月份:2015年12月

【水晶视角】精准医疗在中国:我们还缺些啥?


2015-12-20 水晶基因

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文/水晶基因

【精准医疗的概念在不到一年的时间里传遍大江南北。从政府到民间,从医疗界到企业界,从投资人到老百姓对这一名词早已耳熟能详。精准医疗显然已经成了2015年的年度热词。然而,它是美国用来忽悠世界的阴谋?还是市场上又一次昙花一现的炒作?我们真的理解精准医疗的精髓吗?在炙手可热的当下,精准医疗这锅99度的水还缺乏什麽? 作为整个大的医疗产业界,如何正确认识精准医疗,看清精准医疗发展的机遇和切入口,并及时调整战略,对于相关产业界尤其是制药业、诊断业、治疗业和健康咨询业的生存和发展至为关键。本文旨在深入剖析精准医疗的本质,指出中国精准医疗市场的关键问题和挑战,提出相关行业的重要切入口。】

什么是精准医疗?为什么各国都重视精准医疗?

现代医学进入精准医学时代代表了医学史上的第三次革命:循因医学的建立(Mechanism-based Medicine)【前两次可以划分为医学与巫术的分离(第一次革命)以及循证医学 (Evidence-based Medicine)的建立(第二次革命)】。这一转折是循证医学基础上分子生物学引入医学发展的必然结果。在这个大的框架下,医学诊疗模式面临全面的改革

中国作为发展中国家(尤其是医疗方面)和世界上人口最多的国家,在这一转折的关键时期,如何适应这一革命性的趋势并迅速建立新的诊疗模式对国家的发展和国民健康至关重要。

首先,精准医学的出现既不是美国“战忽局“的阴谋,也不是商业界的一时炒作。它是医学发展的必由之路。一经出现,就不会回头。这个跟电话和手机的发展史有相通之处。智能手机的出现代替了以前的手机和“大哥大”,这个趋势不会逆转。

其次,精准医疗既不是简单的DNA测序,也不仅是大数据的收集,更不是使劲砸钱买仪器设备,它首先是医疗,是一种新的诊疗模式。这种模式要遵循医学规律并要有更高的质量。

为什么精准医疗从美国开始?这是因为:1)美国的医疗系统相对比较完善,2)生物医学研究的成果转化非常普遍,3)精准医疗能够解决当前美国疾病诊疗中重要的问题。4) 精准治疗中的诊断成本仅占医疗成本的不到5%,然而它却可以影响近70%的治疗成本。

中国为什么应该重视?有以下几个原因:1) 这是国际医学发展的必然结果,尽快切入有可能弯道超车;2)国家进入老龄化,医疗问题在经济上成为国民经济越来越大的负担;3)国家经济刚好走在出口导向向消费和服务导向转型的关键时期;4)医疗产业是刚性内需且边际效应巨大,可以有效拉动整体经济发展。

精准医疗模式的建立是一个系统工程。精准医疗的目的是解决两个现代医学的核心问题:1)如何确定病人群体的异质性?以及 2)区分以后怎么办?这两个问题,既是一个科研和转化的问题,也是一个医疗问题。由此直接和间接涉及的行业和相关产业数量巨大。

例如针对第一个问题就会直接涉及到众多科研部门与医疗部门的合作、样本的收集与保存、临床症状和数据的详细记录与储存、大规模数据库的建立与分析;然后是诊断业实现合理的转化,这要涉及到诊断服务业本身及诊断仪器、试剂和技术开发行业;而医疗业要采用和切入这些成果,需要涉及到医疗本身、咨询及健康管理业以及保险业务;

对第二个问题则涉及到制药业的切入,开发针对特异群体的靶向乃至基因药物,以及药物应用到临床的诸多环节。当然整个过程离不开信息咨询业、行业管理的参与、政府层面的立法和监管。更加重要的是,医学教育行业的全面切入和升级。在此基础上整个社会的伦理、法律和道德层面等甚至都有深入的涉及。

精准医疗在中国:问题和挑战

精准医疗在很短的时间内进入国内医学界的视野,迅速得到各方面共识的同时也很快反映出了很多问题。我们先来看看精准医疗要在我国发展要涉及到哪些要素:市场、资金、技术、人才、规范、社会和人们的认同度。我们分别简要分析一下:

市场:中国具有最大的精准医疗市场。世界最多的人口,正处于发展中到中等发达国家的转变阶段。人口寿命不断延长,各种疾病尤其是各种慢性病发病率持续上升,同时环境的污染,预防的难度加大,出生缺陷的比例也在上升。全国肿瘤登记中心发布的2012年数据显示,中国每年新增癌症病例约350万,每年约有250万癌症病人死亡。另据统计,当前中国出生缺陷发生率约5.6% 每年新增90万例。因此,仅从诊断业这一个行业就前景广阔,更不要说制药业,我们迄今还是一个非常初期的阶段。

资金:国家、企业及个人持续投入,目前没有明显的资金缺乏的迹象,当然取决于投向那个方面-这正是我们今天需要解决的问题。

技术:表面上我们现在不缺技术,实际问题很大。主要反映在:

  1. 市场过度迷恋二代测序(NGS)。目前我国提供二代测序服务的公司仅肿瘤高通量测序在最近卫计委室间质评中正式报备的就有88家。这还不算那些没有报备的、以科研目的打擦边球的、及以二代测序检测其他疾病的公司。这些公司绝大多数是在过去1-2年间成立的。对比美国这个医疗极为发达的国家,全国通过CAP 资质认证的提供NGS的实验室目前共有85 家左右。那么相对于我们国家的人口,未来毫无疑问我们当然还需要更多的实验室;而如果考虑到中美现阶段医学发展的程度差异,我们国家现在的数量则绝对超标。
  2. 从事二代测序的公司数量很大,但质量很差。目前国内大多数从事二代测序的公司其实都没有合格的资质(据统计超过70%)。最新的室间质评表明,能够提供100%正确诊断的实验室仅为17%。对比美国,由于他们实行行业协会和政府双重监管,上述85 个实验室均具CAP/CLIA认证资格,CAP采用年度审查和类似的室间质评,不合格的会关闭整改,因此基本可认为他们的合格率在100%。
  3. 高品质的定点检测(targeted detection)方案奇缺。我国目前没有实行LDT(实验室自行设计检测方案)制度,而是所有检测方案统一通过卫计委审核。目前对疾病的分子诊断已经审批的试剂盒仍然很少。例如,到目前还没有任何针对相对罕见的遗传疾病检测的试剂盒通过卫计委审查(当然这种审查有很不合理的地方,后面我们会谈到)。对比美国,各种合乎资质报备的遗传检测方案超过32000种, 超过90%是LDT基础上的定点检测或Panel检测。它追求的是快速、准确、低成本、可持续。国内市场普遍存在对二代测序技术的追捧和迷恋,而相比之下目前二代测序技术远未达到这四点要求。
  4. 体外辅助诊断试剂与器械(IVD)开发有误区。我国由于目前没有LDT审批制度,几乎所有的实验室检测都需CFDA/卫计委审查,也就都成了的所谓的IVD。这一方面导致很多实验室检查审查过度,一方面真正的IVD市场受到制约。

才:本土精准医疗行业的各类人才奇缺。仅以诊断和治疗业为例,这些人才包括:临床遗传科医生、高资质的诊断实验室负责人(诊断师);合格的实验室技术人员;数据分析与管理人员;分子病理师,精通药物遗传学与个体化用药的临床药剂师,遗传咨询师及社区和个人健康管理师、精准医疗行业管理人员等。以相对成熟的美国市场为例,各类临床遗传专科医生超过2000位。美国自1982年开展对临床诊断师、咨询师的培训,现有各类有资质的诊断师1900 人,有资质的遗传咨询师4000余人。这些对于快速发展的美国诊断市场仍然供不应求。反观中国,真正具备完善训练的临床遗传专科医生依然十分稀少。我国也没有临床诊断师和咨询师培训制度。拥有美国资质认证的诊断师在中国工作的不超过5位,而全世界懂中文有资质的遗传咨询师不超过5人。

另外,目前国内现有临床医生普遍对精准医疗缺乏足够了解。遗传学知识与基因诊断知识严重不足。去年针对北京协和医院医生做的一项调查表明,医生对遗传学知识的个人评分平均只有2.1 (4分为满分)。有超过80% 的医生不了解一代、二代测序及基因检测芯片技术;而84%的医生希望加强遗传学的再教育和训练。这已经是国内顶级医院的情况,遑论地方和社区内的医院。从美国的情况来看,仅诊断医疗业我国面临的核心人才缺口就超过2万人

而目前的医学教育界对这些人才缺口普遍缺乏认识和重视。针对上述核心人员的培训、审核和资质认证系统尚未确立,进一步导致国内诊断界形成以技术人员为主、二代测序过热的畸形发展趋势。如前所述,精准医疗首先是面向病人的医疗系统,高资质,高质量临床人员的缺乏会进一步扭曲这一市场,在一段时间内很难得到快速的解决

市场的规范度:如前所述,目前国内市场的规范度有限,在政府的层面缺乏足够的立法和监管。很多审查多头管理,信息混乱。缺乏统一的人才、检测和诊疗系统的管理。这进一步加剧了精准医疗市场质量的下降和恶性竞争。除了上述室间质评反映出的低质量问题,大量缺乏循证医学证据的所谓健康体检、智力检测、性格检测等进入和扰乱市场,跑马圈地的恶性竞争层出不穷。这些因素不但会造成市场“劣币驱逐良币”的情况,也会降低整个精准医疗产业的公信力和社会认可度,最终就没有赢家。再以美国为例,政府很早就推出详细的针对诊断业的监管立法(CLIA)。同时多个行业协会进一步参与质控、质检和行业自律。FDA则进一步审查各种检测的合理性和循证规范,形成了一整套分工明确,训练、认证、审查、批示、监管的体系,行业就会持续良性发展。

社会认可度:社会认可度在很大程度上会影响精准医疗行业的市场和发展。目前国内市场上普通民众对精准医疗的了解还不够,对各种遗传与基因检测的认识严重不足。这一点从上述对医生的调查可以侧面反映出来。这一方面这使得整个社会对精准医疗服务的需求不足,民众认识的不足也就无从分辨服务质量的高低从而进一步加剧整体服务质量低下的情况。另外,由于质量体系和人才的缺乏,高品质的遗传咨询和健康管理服务严重缺乏使得社会和公众对整个精准医疗的服务内容和检测结果一头雾水。水晶基因曾经密切研究过市场上各大诊断公司的报告。大多是拖沓冗长,有的长达数百页。大量无关信息堆砌而关键信息不明确。缺乏高素质咨询师对报告的解读和科普。这也进一步降低了社会的认可度。

综上,目前国内精准医疗行业存在临床环节薄弱,人才严重不足,市场监管不够,质控与质检环节普遍缺失,尚缺乏整体系统的建设。另一方面,受二代测序“神话”误导,市场普遍存在投资失衡和盲目的倾向。

相关产业的机会在哪里?

我们看到国内精准医疗市场的问题,也就看到了整个市场的机遇和下一步的发展方向。既然精准医疗模式的建立是一个必然方向,那么我们国家可以说是完全处于发展中的初级阶段。因此,毫无疑问整个精准医疗行业是朝阳产业,而且这个趋势会在我们这个广大的市场上持续相当长的一段时间。那么切入什么样的方向来共同完善这一系统从而使其进入一个良性循环不但是业界的共同良心所在(事关生命与健康!),也是在经济上能够保证投资得到持续回报的根本

方向一:提高质量是核心问题。水晶在前面反复强调精准医疗首先是一个面向病人的医疗服务。事关生命与病人长期生活质量,来不得半点马虎。在整个世界和人类社会迅速向个人中心主义发展的当下,不注重质量的服务会迅速被淘汰。恶性竞争只会葬送整个行业。因此在精准医疗行业发展到现在应当从普遍跑马圈地的“战国时代“思维进入注重潜心提高质量的”文景时代“。国家与政府在进一步认识到质量问题之后,必然会加大监管力度,以后会看到各种质评进一步增加。因此,不注重质量的企业会逐步被淘汰。

然而,要提高整个行业的质量和素质则是一个系统工程。这包含了有效的政府和立法层面的监管、行业的自律、人才素质的提高和技术标准的提高等诸多方面。可以想见,进一步提高检测、诊断和医疗技术的标准以及提高从业人员素质是民间及企业界所能够迅速涉及的主要方向。

前面提到,国内市场上高品质的定点诊断方案依然严重不足。因此,将来的发展应当摒弃测序解决一切的错误思维,老老实实做一些扎实的诊断方案开发。这并不意味着抛弃高通量测序,毕竟毫无疑问这是未来的技术发展方向。而是应当在实践的过程中使其回归它目前技术局限范围内的发展(例如美国市场的多数NGS的检测还是panel-based 检测,并局限于快速排除方面的应用),同时在其技术不断发展的过程中逐步提升其在诊断行业的应用区间。

其次,精准医疗在世界范围内也仍处于初级阶段。FDA审批通过的与个体化药物治疗相关的分子标识目前不超过200个,这一数字每年在迅速增加,但相对于市场上已有的几千种药物,上万种疾病和各种医疗手段,这些进展仅仅是个开始。在精准医疗的框架下,未来几乎每个药物,疾病和治疗方案都要通过分子检测对人群加以有效区分,因此新的分子标识的开发就势在必行。这里除了政府对科研的持续投资,我们也看到国际市场上的商业投资规模更大。新的分子标识的开发和转化是保证高质量精准医疗服务的前提。

方向二:人才的培养和教育。在可见的将来,在电脑无法足够强大到代替人脑做出综合决策之前(如果达到这一状态,那整个世界就是另外一番景象了),精准医疗的发展仍严重依赖临床的主导,而且数据越多,就越依赖人做出最终的决策。这是以人为本的医学发展趋势决定的,不以个人意志为转移。人才可以引进但真正的解决之道应当是本土的人才培养与教育,毕竟美欧发达国家的高资质人才也是供不应求。

按照前述人才缺口,水晶估算在未来的5-10年,仅精准医疗的教育市场就超过200亿元的规模。因此,如何引进各种师资,尽快开展高质量的人才培养和培训、认证及资质审查系统既是国家的任务,是民间和企业的有效切入方向

方向三:密切“联系群众“,逐步完善系统。精准医疗是面向患者和病人的医疗服务,必须提高社会认知度和个人的整体认知水平。跟智能手机的使用一样,用户需要体验和培养。这就需要高质量的数据解读、咨询和科普工作,逐步建立服务业的公信度和客户的认可度。因此,医疗咨询业、保险业和健康管理业的进一步发展至为重要

方向四:个体化药物的开发是解决问题的关键。如前所述,精准医疗的目的是‘个体化”医疗。因此,开发针对性群体的药物已经在国际制药业形成一股潮流。尤其是癌症治疗和罕见病治疗领域。筛选、设计、抗体治疗和针对变异基因的遗传疗法已经成为药物开发业中越来越重要的领域。在精准医疗的概念下,每个新药都应朝向特定人群以避免严重副作用及提高药效。美国FDA每年审批的新药约30%都与特定人群用药有关。

开发个性化药物需要转变传统的制药业思路。在新的思路下,虽然新药的市场会缩小,但开发成本大大降低,这对我国目前的形势下迅速切入,实现弯道超车提供了很大的可能性。可以想见,个体化药物的开发,必然伴随相应的分子诊断方案和临床使用及评估系统。这就进一步回到了我们谈到的整体的系统建设的概念上。

【综上,正确认识精准医疗的概念的发展趋势,找准行业的缺口和切入点对于关新行业发展的相关各方意义重大。水晶的分析仅是一家之言,篇幅有限,难免挂一漏万,错误之处也在所难免。谨供参考的同时也期待抛砖引玉,愈辩愈明。】

参考文献:

1. 图片来自https://www.ucsf.edu/news/2015/04/125111/california-launches-initiative-advance-precision-medicine

2. Li J, Xu T, Yashar BM. Genetics educational needs in China: physicians’ experience and knowledge of genetic testing.Genet Med. 2015 Sep;17(9):757-60.

3. https://www.genetests.org/

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林林疾病的确诊为什么这么难?


2015-11-29 水晶基因
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文/水晶基因

原载于【TAALSM校友】微信公众号

清华校友孩子林林的病例牵动着无数人的心。而自信息发出已近半年,不但我们国内的精英基因检测团队悉数参与,国外尤其是美国的多个遗传病检测中心的专家们也参与了各种意见和建议。但遗憾的是至今对这个病例尚无明确的诊断。到底是哪个基因出了问题?为什么遗传病的确诊会这么难?为何林林的父母没有任何症状,而林林与其妹妹都会患病?这些疑问不但困扰着遗传学家,也困扰着广大关心这一病例的每个普通人。同时遗传病,DNA突变,基因诊断,大规模测序这些名词越来越频繁地进入我们的视野。什么是遗传病?遗传病离我们有多远?基因诊断又是怎么回事?遗传病能够预防吗?其实我们每个人都应当有一些遗传病的基本知识,未雨绸缪,就会使我们避免很多疾病的发生,即使疾病来临,我们也能知道怎么做。这一期的水晶视角将带领大家通过对林林病例的进一步分析来了解:

1. 林林的诊断目前走到哪一步了?

2. 怎样理解基因诊断报告?

3. 为什么林林的确诊这么难?

4. 遗传病离我们有多远?

5. 面对遗传病我们该怎么办?

6. 下一步的建议

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林林的诊断走到哪一步了?

这个夏天以来由于一个特殊的家庭,林林小朋友的家庭,将五湖四海的遗传学家,临床人员以及众多关心这个家庭的普通人联系在了一起。

823日林林家庭通过清华校友会发出求救信息,已近30家国内外的医院,基因检测机构及遗传咨询机构先后介入。这些机构先后组成了三个主要的“攻关小组”(见下表一),先后对林林、芊芊及其父母的基因进行了各种检测(见下表一总结)。

水晶团队曾在1016日发表了《林林离确诊还有多远?》的博文,综述了林林和其妹妹的患病经过并分析了一些可能的线索(1)。林林家庭的情况,他本人以及妹妹芊芊的病情在前面的几篇文章中均已提到。水晶视角的综述《林林离确诊还有多远?》亦详细描述了林林的病情,在此不再赘述。那么,目前各个攻关小组的研究到哪一步了?

最新的进展来自于清华校友会组织的“Fellowship For Linlin (FFL)”攻关小组。清华生命科学与医学校友会(TAALSM)联合北京希望组在113日发表《林林病因诊断初步报告-1》,综述了诸多参与团体包括水晶基因围绕林林的诊断所付出的辛苦劳动并汇总了诊断结果。

119日,清华校友会与北京优乐复生科技有限公司进一步联合推出了《林林病因诊断初步报告-2》,对通过测序找到的几个基因进一步分析。随后清华校友会邀请水晶基因,从科普和广大非专业读者的角度来诠释这一病例,以期让更多的人了解林林的病情以及了解遗传病、基因诊断和遗传咨询的一些基本知识。以上所有文献经林林家庭及清华校友会同意,我们已经永久保存在水晶基因的网站上与大家共享(www.crystalgene.com/blog)。

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表一. 参与林林病例解读的攻关小组及迄今取得的进展。注:1.Fellowship For Linlin 组包括清华大学医学院,阜外医院,南加州大学,香港大学,北京希望组,米宝有约等;2.“第三小组”包括药明康德明码生物,复旦儿童医院,贝勒医学院,波士顿儿童医院等。↡德易东方为独立解读报告,并非华大攻关小组成员。#其它未见明确诊断报告的检测没有包含在表内(见下文)。

下面我们先来简述一下目前几个攻关小组的发现。从表一可以看出,几个攻关组都对林林核心家庭成员的细胞核DNA以及线粒体DNA做了全面的分析。

先后有两个小组的研究都排除了线粒体DNA突变导致疾病的可能。同时,北京希望组的分析重点发现了林林与芊芊的细胞核DNA均含有PFKMSIPA1 基因的错义突变,林林自己还有COL6A5基因的错义突变,而其父母均无上述突变。其中PFKM和COL6A5基因的错义突变的情况此前在以明码生物为代表的第三攻关小组的研究中也有发现。水晶也与博士360的周在威博士取得了联系,他也确认了在明码生物组的测序中也已发现SIPA1基因突变,只是认为与疾病关系不大而未报道。华大基因小组在最初报道(9月5日)中也观察到了PFKM突变,该前期报道水晶基因已经在《林林离确诊还有多远?》一文中综述过,不再赘述。

那么,这些DNA突变是造成林林和芊芊患病的罪魁祸首吗?如何理解这里的各个名词和概念呢?别着急,水晶带您来一点点抽丝剥茧,先了解一些基本的知识

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怎样理解基因诊断报告?

一个专业的诊断报告往往含有大量技术性和专业性术语,非专业人士看起来就会一头雾水。水晶试图发挥我们遗传咨询和解读的专长,给大家介绍一些基本知识。

首先,我们来看看什么是遗传病,遗传病是怎么引起的?遗传病的诊断为什么要研究DNA和基因呢?

一个家庭中先后出现孩子出生后不久就患病的情况,并且症状有所重叠。这些都是遗传病的重要特征。说到遗传病,一般人会以为就是指由上一代传给下一代的疾病,这种想法不是完全正确。

在医学上,遗传病(Genetic Disease)是指由于某一基因或染色体异常而导致的一种病理缺陷。并非字面意义上 的遗传或上下代传递而来。有的遗传疾病并非继承而来,这点我们会在后文阐述。而反之并非所有上下代间传递的疾病就是遗传病。

例如很多病毒(如HIV)可以在孩子生产的过程中形成母婴传递。而很多其他由感染或环境因素(如地区性微量元素缺乏)导致的疾病由于在同一个家庭中有多个患者,有时也会被误解为遗传病。

大家都知道DNA是遗传物质,DNA负责上下代之间信息的传递。人体的DNA包括核基因组DNA和线粒体组DNA(见图一)。核基因组DNA2346条染色体的形式存在于细胞核中。这23对染色体包括了一套来自于父方的染色体(精子携带),一套来自于母方的染色体(卵子携带),合在一起称为双倍体(Diploidy)。

每一条染色体就是一个连贯的DNA纤维加蛋白质的线团结构,有点类似中国结上的穗状装饰。一个基因就是这条纤维上的一小段,用于编码特定的蛋白质来执行生物功能。DNA在化学上是一个碱基配对的双螺旋结构。DNA含有A, T, GC四种碱基。就是这四种碱基的排列组合编码了我们这个多姿多彩的生命世界。整个人类的双倍体基因组共有超过60亿碱基对。试想其中有一个碱基坏掉(我们称为突变)就可能致病,是不是十分可怕?

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图一. 图解核基因组DNA和线粒体DNA(www.scienceschool.org)。

人体的上百万亿个细胞,其细胞核内的DNA序列在理论上是相同的,都是从受精卵的那一套DNA拷贝得来。在受精卵中因为父母双方都贡献一套染色体,那么发育成个体后每一个基因我们就会拥有两个拷贝。篇幅所限,我们大体讲述一下常见的突变传递模式。

首先是孩子可以从父母遗传获得突变。这个容易理解。还有其他的方式孩子会得到DNA突变:一种情况是在父母的精子或卵子产生的过程中由于某种内外界因素产生了突变,发育成孩子后就有可能会得病。这种情况因为只是在精卵产生的过程发生突变,父母的其他细胞正常,因此父母不会显示任何异常,而孩子会得病。第二种情况是父母精子、卵子均正常,而在受精卵发育的过程中部分细胞发生突变。这两种方式我们称为新发突变

虽然都是新发突变,它们的遗传表现可以不同,前者孩子的所有细胞都会携带这一突变,得病的几率就大些,后者只有部分组织和细胞携带这一突变,只有突变的这些基因恰好影响到其所在细胞的功能时可能才会发病。由于同一个个体携带不同基因型的细胞(正常或突变),这种个体就称为嵌合体

我们再进一步推理,在这样的嵌合体个体中,如果新发突变恰好只发生于部分、全部生殖细胞或包含生殖细胞在内的多种组织。虽然这个个体自己可能是正常的,他(她)在婚后生子时就会出现全部或一定比例的孩子出现突变(图二)。

无论是哪种情况孩子获得突变,DNA突变是否引起疾病可以有两种常见的模式:对某些基因来讲,一个拷贝坏掉没关系,另一个拷贝还能够发挥作用。但另外一些基因只要一个拷贝坏掉,它的功能就不能正常发挥,从而导致疾病发生。前一种情况我们称为隐性突变,即孩子只有在他的两个基因拷贝上都有突变而坏掉后才会得病。后一种情况我们称为显性突变,即孩子只要有一个基因拷贝突变坏掉就会导致孩子得病。

662图二. 新发突变产生各种可能嵌和体的过程及其进一步遗传造成的可能后果。

上面谈了细胞核DNA的遗传特征。我们再来介绍一下线粒体组DNA(3)。顾名思义这些DNA存在于线粒体中。线粒体是人体细胞的“锅炉房”,通过“燃烧”糖类和脂类等分子来产生能量。线粒体DNA编码多个与能量产生及新陈代谢密切相关的蛋白质。因此如果线粒体DNA出现突变,也可能会导致各种疾病。

线粒体DNA是多个拷贝的环状DNA,称为多倍体(Polyploidy),这一点区别于核DNA的双倍体概念。每个环状线粒体DNA大约有一万七千对左右的碱基。线粒体DNA的一个特点就是人体不同部位的不同组织细胞,可以含有不同拷贝数量的线粒体环状DNA,拷贝数可以从几百个到数千不等(图一)。例如红细胞不含有任何线粒体DNA,而肝细胞则含有高达几千的线粒体DNA。

线粒体DNA突变导致疾病其遗传有特殊的方式:一是母系遗传,即只有母亲把病症传给下一代,而在下一代中,只有女儿继续传给外孙/女。而儿子即使患病,由于其精子中的线粒体不会遗传给下一代,其后代就均为正常。

这是为什么呢?机制源自于最初的受精过程。在精卵受精时,父方精子内的线粒体进入卵子后在与卵子融合为受精卵时都被降解掉了,这样精子里的DNA就只有含有23条核染色体DNA的部分与卵子融合。所以受精卵的线粒体DNA均来自于母方卵子提供的线粒体DNA。

另一特点就是异质性(Heteroplasmy) 。线粒体异质性是指在一个个体的细胞中有不同类别(如正常与突变)的线粒体DNA。而在不同组织细胞中,异质性的程度,即不同类别的线粒体DNA的比例可能不同。比如一个母亲可以在她的生殖细胞里面异常线粒体DNA占多数, 但是在她的肌细胞,血细胞中却是正常的线粒体DNA占多数。

这种情况下母亲可能不表现出明显症状,而却有高风险传递线粒体突变至下一代。而由于异质性以及线粒体向子代传递时的随机性和瓶颈效应,携带有某种线粒体突变的母亲可以传递给各个子女不同数量的突变线粒体DNA,进而导致子女之间的临床表现迥异。

有了这些基本知识,再来理解那些专业报告就容易多了。

首先,几个攻关小组先后检测了林林的细胞核与线粒体DNA,说明在线索不是很清楚的情况下,大家都不想放过任何可能的蛛丝马迹。就林林和芊芊来说,由于他们的症状涉及高能量消耗的肌肉系统,而线粒体是机体的能量工厂,许多肌肉病是线粒体相关基因突变所致,攻关小组选择既检测细胞核又检测线粒体DNA是有道理的。

其次,那么林林和芊芊的病和他们父母之间是怎样的一种遗传关系呢?我们看到林林和芊芊都是出生之后不久就患病,出现不尽相同但部分类似的情况,而父母完全正常,经过希望组进一步访问确认,其父母双方均无疾病遗传史。这就意味着几种可能:

一是隐性遗传突变:父母在某个基因上各携带一个坏的拷贝,而且不幸都遗传给了两个孩子。这种情况当然很常见。那么这种概率有多大呢,根据遗传学的基本定律,这种情况在所有出生的孩子中出现发病孩子的几率会占到25%。也就是说每个孩子同时得到两个坏拷贝的几率是四分之一。林林父母只生了两个孩子,因为这个数量较少,恰好出现两个孩子都遗传两个坏拷贝的几率就有25%X 25% = 6.25%。虽然较低,但这种情况不能完全排除。

二是线粒体遗传:线粒体疾病的发病机制和临床表现复杂多样,母亲没有症状而孩子发病的情况并不少见。

三是嵌合体遗传:即父母双方至少一方的生殖细胞的部分、全部或生殖细胞以及其他部分组织细胞的DNA发生突变,然后遗传给了孩子。即图二下半部分中显示的那样。

以上三种情况均基于一种假设:就是异常的遗传物质是从父母继承而来。还有一种情况是突变并不来源于父母,那就是:

四、新发突变:在精子或卵子发育或胚胎发育的过程中,由于种种原因出现突变,从而导致孩子全部或部分细胞出现突变(图二的上半部分)。这种情况虽罕见,但也可以解释父母正常而孩子得病的情况。

那么,根据这些特征我们来分析一下目前得到的结果符合那种情况呢?

首先,如果符合隐性遗传突变这种情况,那么检测出的基因就应当有至少两个突变存在,且分别来自父母双方。根据目前结果,找到的三个基因都是只有一个可能的坏拷贝,而另一的拷贝不含突变(即报告中所谓杂合突变)。同时,“Fellowship For Linlin”小组在检测到林林DNA含有这些突变后同时在芊芊DNA中检出相同的突变,而孩子父母的DNA中均不含该突变,因此并不符合隐性遗传的特征;

再来看新发突变。两个孩子均发生新发突变,排除这一位点为热点突变位点的情况下,而且突变发生于基因的同一个位置,这种几率就很小了。因此可能性极低。

再就是父母至少一方嵌合的情况。这种情况父母至少一方其全部或部分生殖细胞中携带这两个新发 突变,所以在父母的血细胞中检测不到,但是两个孩子可能都携带突变。因此,目前看来这种嵌合体遗传的可能性最大。当然还有线粒体遗传,三个小组检测线粒体DNA不存在可疑突变。

这里水晶要特别提示注意一点,因为目前各小组只检测了林林的外周血细胞,其他组织尤其是肌肉组织中出现线粒体突变的可能性不能完全排除。

还剩下一个最重要的问题,检出的三个基因PFKM,SIPA1及COL6A5是导致孩子发病的突变基因吗?让我们来一个个分析一下:

首先,各个攻关小组均观察到了PFKM基因的突变(表一)。PFKM(phosphofructokinase, muscle type),即编码肌磷酸果糖激酶的基因。该基因在林林和芊芊的DNA上都含有一个错义变异,p.Glu629Lys,即在编码第629个氨基酸的位置上发生了一个突变,从而使得原先编码的谷氨酸变为一个赖氨酸。而这一置换在父母中均未检测到。前文分析了这种遗传现象极可能是由于父亲或者母亲中出现了嵌合现象。

如果有必要的话可以用父母唾液(如果口腔部位细胞存在嵌合),精液(作为父亲的生殖细胞,而卵子一般很难取到)等血液之外来源的样品DNA来进一步验证。但这一现象只是提示生殖细胞嵌合体这一现象的存在,并非证实PFKM为致病基因。

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图三. 磷酸果糖激酶(PFKM)突变造成糖原贮积病的原理。该酶突变后功能丧失,其上游产物积累,下游产物缺乏。

PFKM是糖原贮积病7型(Glycogen Storage Disease VII, GSDVII)的致病基因 (4)。 这一疾病是常染色体隐性遗传病,即需要PFKM基因的两个拷贝都有致病突变才会致病。这一基因突变导致的糖原贮积病会导致肌肉中的糖类分子(我们身体里的用于产能的原料)以糖原(聚合体)的形式贮积而不能被利用,这样就造成能量不足而产生肌肉无力 (见图三)。

听起来跟林林兄妹的病情有一定的类似性。但由于林林和芊芊均只携带一个拷贝的突变,并不符合隐性遗传的模式特征。一种可能是PFKM基因仍遵从常染色体隐形遗传模式,但在林林,芊芊的样品中还有一个PFKM的致病突变尚未找到。

漏检的原因可能是测序没有覆盖,比如已报道的一个PFKM剪切突变,IVS16-64G>A。这一突变存在该基因的十六号内含子中,离内含子/外显子边界较远,有可能外显子测序没有覆盖而漏检(下文会介绍何为外显子和内含子)。

另一突变漏检可能是PFKM基因中有小片段缺失或扩增。对于DNA片段的缺失或重复希望组和优乐复生都分析了检测DNA拷贝数的芯片数据,但是由于探针在PFKM区域的密度不够,没有检测到PFKM的缺失或重复。这种小片段的缺失或扩增用二代测序也很难发现,可能需要用高灵敏度的MLPA, real time PCR, digital PCR等技术。

当然还有其它更加罕见的原因可以解释一个拷贝坏掉也可能导致疾病的可能性,但作为遗传诊断和解读,也要防止“射出箭再画靶”的过度解释。一切皆有可能的情况下掌握的原则应是可能性大的情况为主。而且,遗传的解释离不开与临床症状和临床其他检测的密切配合,我们会在后文进一步阐述。

再看一下”Fellowship for Linlin”报道的另外两个携带错义变异的疑似基因:SIPAI和COL6A5。

由于SIPAI至今报道较少,水晶基因也做了大量搜索,尚未发现有公开的报道表明这一基因与肌肉系统遗传疾病有联系的报道。虽然作为一个新出现的例子可能性不能排除,但缺乏其他生物学证据的情况下,一个病例作为“孤证”就很难下明确的结论。

COL6A5是一个胶原蛋白基因庞大家族 (序列上和进化上存在来源相似性的基因)的成员之一。其家庭成员基因COL6A1,COL6A2,COL6A3的突变的确可以诱发一系列的先天肌病,如Emery-Dreifuss肌病,Limb-Girdle肌病,杆状体肌病等。COL6A5可能会通过和COL6A1/2两个蛋白的相互作用而可能会诱发肌病。

但与SIPAI的例子相似,在缺乏其他证据的前提下无法做出明确结论。而且在芊芊DNA中也不含此突变,因此其作为林林特有的新发突变的可能性很大。从这一点也不太支持该突变导致两个孩子患病的可能性。

小结一下:经过最近的攻关,找到了三个疑似突变。但通过遗传模式和证据分析,虽然发现存在嵌合体遗传的情况,仍无过硬的证据表明其与林林和芊芊的病症有关。

水晶也要特别指出,嵌合体遗传并不是导致遗传病的先决条件,实际上人群中嵌合体的况并不罕见,只是绝大部分的嵌合体遗传并不导致遗传病,也就不被注意。

因此,这几个错义变异有可能只是比较罕见的中性变异,与林林芊芊的患病并无关系,而真正的致病突变反而被漏检了。听起来很泄气?那让我们来看看为啥遗传病的确诊会这么难?

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为什么林林的确诊这么难?

林林的病例经过了反复几轮的检测,结论仍不明确。说他这个病例是目前世界上被最多专业人士关注,而且DNA测序最彻底的一个病例都是完全有可能的。然而,花费了这么大的精力仍然结论不明,未免让人困惑

那么遗传病尤其是罕见遗传病的确诊难在哪里?这里有几个方面,水晶大体归结一下:逻辑方面,技术方面和检测流程方面。让我们分别来看一看。

如果组成人体遗传物质的60亿个碱基中一个碱基的变化就会导致疾病的发生,设想在60亿个碱基中快速确定变异的碱基,寻找遗传病因,堪比大海捞针。在快速、低成本的DNA测序技术成熟之前,人们对罕见疾病(很大程度上是遗传性疾病)的分子机制的了解极为有限。

随着测序技术的进步,使得对病患的整个线粒体组,外显子组,甚至基因组快速解析成为现实。因此我们在近几年对各种罕见遗传病的了解达到了一个前所未有的程度。如果说极罕见遗传病的数量不好确定的话,相对“常见”一些的罕见遗传病在人群中估计就超过7000种,得益于近几年高通量测序技术的大规模使用,科学家们已经确知其中60-70%这类疾病的突变基因。然而,仍有大量的罕见病由于极为罕见,缺乏先例,很难在科学上准确确定病因。

另外,最新的遗传学研究发现,几乎每个新生个体的DNA上都会含有30-50个新发突变,这些新发突变是随机的,只是在大多数时候都发生在无关紧要的位置,也就不会导致疾病。而它一旦落在某个重要的基因上就会导致疾病。这个过程跟买彩票中大奖差不多,我们不想中这个奖,但谁都无法控制这个随机发生的事件。

那么高通量测序技术既然如此给力,是不是见到一个遗传病人把整个基因组测过去就解决问题了呢?当然不是。

大家可以把罕见遗传病的诊断过程想象为侦探抓罪犯的过程。在缺乏有效线索的前提下,在60亿个碱基中找出与疾病相关的那个突变等同于把地球上的每个人分析一遍来找罪犯。一旦某个“地区”的扫描不够精细,或者因为技术原因漏检,就有可能导致“罪犯”漏网。

因此,在高通量测序中,一般要对基因组中编码蛋白质的那些基因部分(大约占整个基因组的2%左右,我们称为外显子)进行反复检测,通常要达到每个碱基都被扫描100次以上。但即使这样,也仍有区域会因为技术的局限性而漏检。要对这些漏检的部分补测(比如用第一代测序技术),检测的最终价格可能就不那么亲民了。

需要注意的是DNA的突变有多种形式,目前不是所有的突变都可以通过测序有效检出,如有些疾病是由于三核苷酸重复序列突变导致,如一型和二型强直性肌营养不良(Myotonic Dystrophy type 1/2); 而有一些疾病是由多个外显子缺失导致,如DMD(Duchenne Muscular Dystrophy)。这些突变类型都容易被常规的二代测序漏检

而且很多致病突变发生在非外显子区,如果只扫描外显子区,对这些突变就可能漏检。这就是我们在分析三个疑似基因时提到的。

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因此,在医学实践上,一种遗传病的诊断跟侦探案一样,一般是首选线索分析,缩小范围。在临床上一般应由遗传科的医生首先做出会诊,在详细询问病史和检查家庭各成员的基础上对病人作出必要的病理检查。通过进一步辨症,可以将疾病确定或至少确定在某个疾病类别的范围中。

这样做有什么好处呢?通过症状推理缩小范围相当于把罪犯锁定在一个有限的地区里,这样负责基因诊断的专家们就可以针对这些最有可能的范围作出更加细致的分析从而有效作出正确的诊断。这一点需要在实践上临床医生和基因检测技术人员的密切配合。

除了高通量测序本身可能的技术因素,遗传病尤其是罕见遗传病的确诊还有另外的难题。通过高通量测序的大规模扫描诚然可以获得海量的数据,对这些大量数据的有效分析却仍是一大难题。对大数据的处理不可能做到精细到每个碱基的分析,只能设定一些参数后通过电脑进行快速分析,这样“一刀切”的方案就容易导致真正的致病突变漏网。

不但如此,即使我们一个不落地找到了所有的突变,如前所述,除了父母遗传给孩子的各种突变,孩子自己还会产生各种新发突变,如何在这些筛出的突变中确定真正导致疾病发生的那个突变也非易事。由于许多罕见病过于罕见,甚至在所有的报道中只出现一例,在科学上就成为“孤证”,缺乏“旁证”很多时候就无法真正确定病因。

比方说,某地一个人神秘地死掉了,查了半天也没发现原因,只是知道他死前被一种蚂蚁咬过。在无法确定其他线索的情况下,也没有见过这种先例,我们很难把这个蚂蚁咬就作为这个人死亡的原因。因为这只是一个孤证。而如果通过网络搜索,我们知道世界上还有好几个人都因为这个蚂蚁咬而死掉了,我们就有更加充分的理由相信这种蚂蚁就是致死因素。如果后来进一步研究发现蚂蚁分泌的某种物质十分致命,那就几乎可以肯定这二者之间的联系了。

综上,对于病因明确的遗传病的确诊在目前测序技术等的发展下虽已经相对容易,然而有的突变类型不易被测序技术检出,就存在漏检可能。而且罕见遗传病由于很多是孤例,缺乏旁证的情况下要做到真正的确诊就比较困难。水晶团队在过去的临床实践中也发现,很多罕见病例会悬而未决很长的时间,而在更多的证据确定后,问题就会迎刃而解。

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遗传病离我们有多远?

从林林这一病例我们引申开去可以学到更多的知识。也许你会说,我们家从没有过遗传病的情况,是不是就不会得遗传病?当然不是。遗传病尤其是罕见病的发生理论上可以发生在任何一个家庭。林林的家庭其实就是父母双方及他们的家庭成员都没有任何问题,而孩子反而患病。

从广义上来说,几乎每种常见及罕见的疾病都或多或少与DNA上的变异有关。遗传病在医学意义上大体有三类异常,包括染色体水平上异常的遗传病(Cytogenetic Disorders),多基因参与的常见疾病(Multigenic disorders)及单基因遗传病(Monogenic disorders)。

我们生活中最为熟悉的可能是医学上称为细胞遗传学异常的遗传病如常规产检所排除的三体综合征(某条染色体不再成对,而是多出一条),性染色体畸形等。细胞遗传学水平上的遗传病在遗传学物质上表现为一组基因,一段染色体,甚或一条染色体,一套染色体的改变。

统计数据显示,有将近1%新生儿具有染色体异常。在高龄产妇的孕检中,有2%显示细胞遗传疾病。以普通人群统计下来,大约每1000人有3.8人有染色体水平上的异常。当然不是所有的染色体异常都会导致疾病。有些染色体的变化如果没有影响到重要基因的功能,就没有非常严重的表现。

很多常见疾病的病因都包含遗传因素。如糖尿病、癌症、心血管病乃至精神疾病等都与多个基因上的变异有关,只是每个变异只对疾病的状态贡献很少的一部分风险,对大多数人来讲,多一个少一个基因变异不会造成很大的区别。只有很多变异综合在一起,再与很多环境因素(如饮食,吸烟,饮酒,运动等)结合时,我们得病的风险就会增加。我们称它们为多基因参与的常见疾病(Multigenic disorders)。

单基因遗传病就只有一个基因的一个或两个突变,而这一个或两个突变就足以导致严重疾病状态的发生。单基因遗传病在1000个新生儿里面大约有10个不同种类的异常。林林的病例可能就是这种情况。

单基因遗传病这么罕见,那是不是就跟我们大多数人无关呢?这是个概率事件。我们只能讲在一般情况下这个概率很低。上文已述,几乎每个新生个体的DNA上都会含有30-50个新发突变,这些新发突变是随机的。不幸的是,我们谁都无法控制这个随机发生的事件。但是我们中的很多人的确会有比其他人更高的风险得上某种遗传病或生出某种疾病的孩子。这里我们梳理一下一些明显的风险因素:

A. 父母双方的家庭中曾有孩子有出生缺陷,如染色体三体,痴呆,唇颚裂等。

B. 大家庭中有其他成员患有遗传疾病,常见的罕见疾病如囊性纤维化,常见疾病如糖尿病等;

C. 父母近亲结婚

D. 有多次流产史或不孕史

E. 高龄产妇

F. 怀孕前或怀孕期间接触过可能胚胎致畸的物质

在这里尤其要强调育龄父母要注意健康的生活。抽烟喝酒都会导致DNA突变几率显著上升。处于其他的劳动环境如高辐射,高化学致畸环境等都会提高精子和卵子内DNA的突变率。孕期服用某些药物也会导致突变的发生。而孕期服用叶酸等制剂则会显著降低神经管发育畸形的比率等等。具有这些风险因素的家庭在规划生育计划时应检查父母父母双方,乃至胎儿的染色体或基因,看是否有重要突变,及早预防。

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面对遗传病我们该怎么办?

很多隐性遗传和随机新发突变及嵌合体遗传引发的遗传病防不胜防。做好预案,未雨绸缪,在面对遗传病的时候掌握正确的思路就会少绕些弯路。很多情况下越早治疗,就越能更好地控制疾病。

首先是要早期预防。对于上述高风险的人群,对育龄期的父母要做各种预防性筛查。高龄产妇要做必要的产前检查。例如染色体三体变异在高龄产妇中的比例会显著高于低龄产妇。以唐氏综合症(21号染色体三体)为例,20-30岁的产妇生出唐氏综合症患儿的比例大约在1000-2000分之一以下,而35岁以上的产妇就会上升到350分之一以上,而到50岁,这一比例会达到10分之一。

对新生儿也应进行必要的早期筛查。例如耳聋和新生儿代谢性疾病,这些疾病往往在新生儿中的发育初期不被注意到,而一旦发病,对身体机能尤其是神经和肌肉系统的功能就已造成不可逆损伤,再治疗就很难矫正,因此早期的筛查一旦查出,可以通过治疗降低很大的发病风险。

其次是注意正确的问诊。任何遗传病的诊疗应当都是一个临床医生与高素质检测技术人员和遗传咨询专家的的充分配合下实现的。高风险人群在做家庭生产计划前应当寻求高质量的遗传科医生和遗传咨询专家的建议。在充分讨论家庭遗传史,环境,饮食及其它因素的前提下,做出必要的检查和合理的治疗。

最后是选择正确的检查方式。在临床医生充分了解病情的基础上应当作出合适的导诊与转诊,在有经验的遗传诊断师的配合下寻求正确的检查方式。前文已经提到,大规模测序的方案虽然听上去非常给力,但作为一种遗传病检测手段目前仍不成熟。事实上,根据病情不同可能有不同的突变的情况下,选择正确、成熟的检查方式不但快速准确,而且花费也很低。

小结一下,遗传病的检控和诊疗是个系统的工程,需要多方面专业人士的参与。作为每个个体,应当加强一些基本知识的了解,做好充分的预案。它归根结底是个医学问题,应当在临床专业人员的充分配合下做出合理的安排

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下一步的建议

通过我们上述的详细分析,水晶方面认为,对遗传病的检控应当通过临床症状分析、循证医学基础上的技术参与以及专业遗传咨询几方面的紧密配合。在林林疾病的诊断方面,迄今各方技术人员的积极参与的确起到了有目共睹的推动作用,然而从另两方面来讲,林林的病例分析从始至终亟待临床医学遗传学专家的主导以及专业遗传咨询的协调辅助。

对遗传病的诊疗归根到底是一个面向患者的医学问题,缺乏临床支持的“众包”方式会导致效率低下,信息混乱,从经济上亦不可持续。这一方面也反映出当前我们临床医学遗传人员的严重不足,另一方面也折射出我国遗传病的检控体系长期不完善,造成目前测序就是“一步到位”的检查手段的误解。

对此,水晶基因就林林的病例专门采访了国内外的几位临床遗传学专家。

卫生部中日医院神经内科运动障碍与神经遗传病研究中心负责人的顾卫红主任是我国知名的神经系统遗传病领域的专家,通过仔细分析之前关于林林一家的临床和基因检测报道,顾大夫认为“林林和芊芊均在婴儿期出现心肌和呼吸肌无力表现,肌肉受累为主,遗传性疾病毋庸置疑。尽管临床表现有一定差距,但是应该是同一病因致病,表型差异与家人对于患儿喂养细节及观察,环境因素和病史描述等因素有关。” 从诊断上来讲,她认为“如果有合适的肌肉病的相关基因组合检查,应该首选”。

水晶也进一步咨询了美国临床医学遗传学界的几位位资深专家。在综合分析林林与芊芊的所有现存病历资料后,专家们一致认为林林的病情更符合先天性肌营养不良症(Muscular Dystrophy),而非糖原贮积病,因此PFKM基因的突变可基本排除

基于这一点,水晶向各医疗小组及林林的家庭提供以下建议:

从症状上来讲,如果林林的病情确属肌营养不良,目前虽无有效治愈方案,按照美国国立儿童健康与人类发育研究所(NICHD)的建议,应当对患儿进行适当体能训练及扩展运动以增加肌肉力量与关节的灵活性。同时要视情况对患儿进行呼吸辅助、语言辅助和自主运动辅助性治疗延长生活质量。必要时通过手术维持生活质量。

亦有研究表明,每天使用糖皮质激素如强的松可有效增加肌肉力量、运动能力和呼吸功能。但因这些激素类药物副作用较大,应在与临床医生充分讨论权衡利弊后使用(5)。

水晶注意到一些关注林林病情的微信群内及其他网友基于最近两篇诊断报告对PFKM疑似突变导致糖原贮积病(GSDVII)的可能性讨论较多。林林芊芊的部分症状如血清肌酸激酶升高,呼吸困难,心脏方面的症状等的确同GSDVII的表现有重叠。亦有网友建议林林进行饮食治疗如服用含有果糖的果汁等。

水晶的建议是在进一步确诊之前应当谨慎和缓行

基于前述对PFKM功能的分析(图三),该酶的功能主要是代谢6-磷酸果糖为1,6-2磷酸果糖,如果该突变确致该酶活性降低,则林林会出现糖原、果糖及6-磷酸果糖积累和1,6-2磷酸果糖缺乏,而并非果糖缺乏。因此,即使PFKM真的是导致林林疾病的原因,该饮食疗法也不会起到任何作用,反而在理论上会导致果糖和糖原进一步积累。

水晶也查阅了大量文献,遗憾的是GSDVII至今尚无有效治疗方案。有报道称酮体(高脂)食物或高蛋白食物在某些病人中可延缓部分病情。而如果是糖原贮积病,医学界普遍的建议则与肌营养不良的建议相反,为尽量减少各种运动。因此,进一步确诊对于林林生活质量的维持仍有很大价值。水晶对此也提出以下技术方面的建议:

如果林林的疾病从症状上缩小到遗传性肌肉肌营养不良疾病这个范围里,目前发现与之相关的基因大约有20-30个。因此对这20几个基因的详细分析应是首选。目前各检测团队对林林DNA的测序已经做了很多工作,但上述与遗传性肌肉疾病相关的基因在这些数据中的覆盖率如何,有无漏检,水晶基因建议各个团队对这些数据应当做充分的分析。

另外米宝有约团队于9月1日发表的文章提示“Fellowship For Linlin” 小组可能已经对上述基因做过外显子捕获后的测序,然而未见详细的检测报告。华大基因在9月5日的报道中也专门分析了36个先天性肌病的基因。综合这些看来与先天性肌病相关的基因内部发生突变的可能性不大。但这些基因是否有片段缺失或拷贝数变异尚无集中评估。有消息表明林林的DNA也还经过了片段缺失等拷贝数芯片的检查,但这一平台对上述基因的检查结果及覆盖率如何亦未见明确报道。

水晶基因为此联系了博士360的周在威博士,他进一步分析了这些基因全基因测序的结果,初步分析表明这些基因存在突变及拷贝数变异的可能性较低,但由于覆盖率不高(20-30X),水晶仍建议对这些基因可能漏检的部分以及内含子区域及其他的突变形式尤其是片段缺失等在合适的平台上做进一步的详细检测。

目前几个团队对线粒体DNA的测序没有发现有价值的突变。然而线粒体DNA和与线粒体功能相关的核基因突变的因素却不能完全排除,尽管线粒体肌病多数发生于年龄较大的个体。迄今未见各组是否对线粒体功能相关的核基因突变尤其是片段缺失做出统一评估

另外,上文提到线粒体的分布在各个组织中并不均衡。组织细胞异质性程度不同的情况不能排除。各组迄今只对林林血液中的线粒体DNA做了排查,并没有深入到林林的肌肉组织。但提取肌肉组织属有创检验,有可能会对病人造成进一步的痛苦,需充分衡量利弊,取得家属和患者本人同意后方可进行。在权衡利弊时还要考虑很多遗传病都无法得到有效治疗。因此,临床上一般尽量倾向无创检验。然而,在本例中,因为PFKM突变是否真正致病仍无结论,医学检验上检测GSDVII的金标准即肌肉活检组织中测定PFKM酶活性,因此综合上述两点,一份肌肉活检样本就有可能获取多方面的检测结果。当然,即使如此,水晶并无参与林林病例考察,无一手资料,因此仍需当事人家庭及主治医生等相关方面结合其他各因素充分权衡。

针对这些反映出的问题,水晶亦希望在组织和协作方面提出以下建议:

一是相关各方应考虑组建有经验的临床相关各科医生主导的信息汇总、会诊、治疗小组,在充分综合目前临床与检测各方面信息的基础上统一指导下一步的检测与治疗措施;

二是技术攻关各方也应进一步协调,在充分共享所有原始数据的基础上对前述可能问题作出充分的检测质量评估,以指导下一步的检测方向。目前综合看来,先天性肌肉营养不良相关基因及线粒体功能相关的核基因的缺失突变应作为筛查排除重点

水晶方面认为在临床专业人员的主导,在其他技术和咨询各方的综合和协调下,才能有效整合资源,防止数据和信息的碎片化,从而避免重复劳动和信息传达的混乱。

总之,在医学知识越来越爆炸的现在和将来,包含遗传病诊疗在内的精准医疗只能通过严格的分工和密切的合作来进行。在做出医疗决定时应当充分基于循证医学证据和权衡各种利弊后进行。同时,从这一病例中我们看到,我们的整个医疗体系需要建立合理科学的问诊、导诊、转诊及会诊制度及可持续性的各方面合理的收费和医疗保险体系,从而让众多类似的患者求医有道,在合理的医疗负担下及时得到正确的医学指导。

最后,水晶再次表达对林林与其家庭的深切慰问。作为罕见病患者,林林是不幸的。但在推动我们对罕见病的了解以及探索正确的遗传病检控方案上,正是林林这样的千百个罕见病的患者成为了我们的老师。林林家庭自始至终的乐观、配合和耐心给了各个攻关团队充分的信心和支持。我们将继续为揭示最后的真相不遗余力。

林林病例的出现,恰逢精准医学的概念引领医学变革和基因测序技术风起云涌的当下,他所引起的关注和各方的努力既为我们普及遗传病知识,唤起大家对遗传病的重视提供了难得的契机,也为我们检视当前我国的遗传病检控体系的现状提供了绝佳的窗口。作为长期关注遗传疾病诊断、解读与咨询的水晶基因,我们希望谨以此文在普及大众的同时也能充分引起同行业者的共鸣,为共同推动我们医疗事业的进步贡献力量。

注:本文的写作得到了顾卫红医生,汪德鹏先生、周在威博士、蓝灿辉博士和王凯博士的大力支持与指导,水晶在此表示由衷的感谢!

参考文献及网络连接:

1.水晶视角博客:林林离确诊还有多远?http://www.crystalgene.com/blog/

2. Zlotogora J. Germ line mosaicism. Human Genet. 1998 Apr;102(4)381-6.

3. Prashant Mishra and David C. Chan. Mitochondrial dynamics andinheritance during cell division, development and disease. Nature ReviewsMolecular Cell Biology 15, 634-646, 2014.

4. Musumeci, O. et al. Clinical features and new molecular findings inmuscle phosphofructokinase deficiency (GSD type VII). Neuromuscul Disord 22,325-30 (2012).

5.https://www.nichd.nih.gov/health/topics/musculardys/conditioninfo/Pages/treatment.aspx

【欢迎个人转发分享,机构转载请注明出处“水晶基因”】

(转载)2015全国肿瘤诊断与治疗高通量测序室间评估报告出炉


原载:转化医学网

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来源:卫生部临床检验中心

随着个体化医学的发展和“精准医学”概念的提出,肿瘤诊断与治疗发展迅速,临床研究逐渐发现并证实更多相关的基因突变。新一代高通量测序因其在通量、成本和效率方面的优势,展现了其广阔的应用前景。2015 年初,国家卫生和计划生育委员会批准了 26 家肿瘤诊断与治疗高通量测序技术应用试点单位,表明了我国开始规范化的肿瘤高通量测序检测。

为了解全国肿瘤诊断与治疗高通量测序检测情况,更好地开展肿瘤诊断与治疗高通量测序检测室间质量评价,卫生部临床检验中心于 2015 年 10 月开展该项目的全国室间质量评价活动,并要求各临床实验室使用日常所用试剂和程序进行检测。本次质评具体情况如下:

一、样本情况

本次共发放 10 个质评样本,编号分别为 1501、1502、1503、1504、1505、1506、1507、1508、1509、1510。所有样本均为人基因组 DNA(从细胞中提取),样本量 30µl,浓度 30~50ng/µl。

其中,1501-1508 号样本检测体细胞突变,提供正常基因组 DNA 一份(样本编号为 15NC),15NC 代表临床上来自患者外周血或者正常组织样本中提取的基因组 DNA。具体信息见表 1。

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二、 检测项目和要求

1. 本次质评的检测项目是肿瘤诊断与治疗高通量测序检测(体细胞突变)。

2. 本次室间质量评价调查活动在向每个参加实验室发送检测样品的同时,附有给实验室的活动说明“2015 年全国肿瘤诊断与治疗高通量测序检测室间质量评价调查活动安排及注意事项”、 “2015 年全国肿瘤诊断与治疗高通量测序检测室间质量评价调查活动结果回报表”。

三、实验室回报结果情况

共计有 88 家实验室回报质评结果,共计收到结果 88 份,其中有效结果 72份(即回报结果完整、在截止日期内回报的结果)。 本次质评中所有实验室使用的试剂,均为实验室自建方法(laboratory developed test,LDT)。

四、评价原则

“肿瘤诊断与治疗高通量测序检测(体细胞突变)”室间质量评价的评价原则如下:

1. 假阴性结果:在检测范围、检测限以上的基因突变均要求正确报告,未报告即为假阴性结果。一个假阴性结果,扣除 10 分。

2. 假阳性结果:预期结果(表 1)以外的基因突变结果报告,均为假阳性结果。一个假阳性结果,扣除 5 分。

3. 错误结果的报告:实验室报告了预期结果内的基因突变,但突变位点错误,错误位点<10 个碱基,扣除 2 分;>10 个碱基,扣除 5 分。

4. PT 成绩计算:所有错误结果累计扣分,满分 100 分。 如检测 20 个以上基因(含 20 个),得分大于等于 80 分则为合格;PT 成绩小于 80 分为不合格。

如检测 20 个以下基因,得分大于等于 90 分则为合格;PT 成绩小于 90 分为不合格。

PT 成绩合格的实验室,融合基因需全部检测正确,融合基因检测成绩方为合格;否则仅点突变、短片段缺失和插入检测成绩合格。

五、 PT 成绩情况

PT 成绩合格的实验室,发放质评合格证书,合格证书中注明实验室的检测基因及类型,且需与合格证书同时使用。

PT 成绩不合格的实验室,发放质评参加证书; 如实验室回报结果不完整、或未在截止日期内回报结果,按照未参加本次质评对待。

本次质评中,实验室 PT 成绩情况见表 2-1 和 2-2。

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六、 对本次质评调查活动的说明

本次质评中,参加实验室检测的基因数从 4~377 个不等。尽管实验室检测的panel 各不相同,但本次质评评价的是实验室采用高通量测序方法检测体细胞突变的能力,因此适用于所有参评实验室。

本次质评实验室合格率仅为 51.2%(37/72),100%正确的实验室仅占总实验室数的 16.7%(12/72),见表 3。22.2%(16/72)的实验室 PT 成绩为 0 分,检测结果极其混乱。总的来说,出现的错误主要有以下方面:

1. 所有样本均检出同一种突变:此错误出现在 9.7%实验室中(7/72),例如ALK、FGFR3、TP53、EGFR 等基因突变出现在所有样本中,且有的突变频率高于 50%。

2. 基因突变位点报告错误:非常普遍。突变位点与预期结果的位置相差 1个碱基到 300 碱基不等,同时突变的碱基序列,插入的碱基序列等均有错误。

3. 融合基因检测错误:融合基因漏检、报告错误的融合外显子。

4. 样本标签识别错误:突变结果报告正确,但该突变结果未出现在预期样本中,而是出现在另一样本中。即 A 样本中的突变结果报告在 B 样本中,且多个突变均有此类错误,但有些突变报告正确,说明实验室并未在检测时搞错样本编号。

5. 假阴性结果:对基因突变的漏检,特别是部分实验室对如 KRAS:c. 34G>C(p.Gly12Arg) (频率>10%)、NRAS:c.35G>A(p.Gly12Asp)(频率>20%)、PIK3CA:c.1624G>A(p.Glu542Lys) (频率>10%)等具有明确临床意义的突变漏检,是非常严重的错误。此外,部分实验室在报告中注明其检测范围是所列出基因的全部突变,但实际上,实验室并不具有这种能力。实验室应当在对检测体系进行性能评价时明确自己的真正检测范围。

从本次质评结果来看,肿瘤诊断与治疗高通量测序检测(体细胞突变)存在很多的问题。检测实验过程、检测的实验原理设计及生物信息学分析均很大程度地影响了最终结果的报告。

实验室应分析本实验室错误的原因,对检测方法进行全面的性能评价,以确认本实验室的检测体系(包括实验过程以及数据分析)是否有能力对检测范围内的突变进行有效的检测,是否能够正确地识别体细胞突变、正确地进行标签识别,确认碱基识别错误和阳性突变、比对正确的突变位置以及实验室是否有必要开展上百个基因的检测,如何避免假阴性和假阳性结果,均是实验室需要思考和改进的方面。

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肿瘤诊断与治疗高通量测序检测(体细胞突变)室间质评证书将于 2016 年1 月 5 日发放。

因年底室间质评工作量较大,肿瘤诊断与治疗高通量测序检测(胚系突变)的室间质评小结以及证书将于 2016 年 4~5 月发放。


通知回顾

继2014年12月15日卫生部临床检验中心发布发布全国产前筛查与诊断实验室室间质评通知以后,2015年4月10日,卫生部临检中心发布《关于开展肿瘤诊断与治疗高通量测序检测(多基因检测)室间质量评价预研的通知》,表示将开展该项目室间质量评价的预研,对全国各相关实验室进行调查。

室间质量评价也称为能力验证实验(以下简称PT),是指多家实验室分析同一标本并由外部独立机构收集、反馈实验室上报结果并评价实验室操作的活动,通过实验室间的比对判定实验室的校准、检测能力以及监控其持续能力。长期以来,PT一直是临床实验室和公共卫生实验室质量保证的一个重要组成部分。

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目前,2015年产前筛查与诊断实验室室间质评已经正式开始检测,卫计委第一批样本已发放,相关文件可登陆卫生部临检中心网站查看下载《2015年全国产前筛查与诊断实验室室间质量评价总结大会课件及通讯录》。而对于此次的肿瘤诊断与治疗高通量测序检测室间质评,根据通知,注意要点如下:

目的:肿瘤诊断与治疗已成为高通量测序临床应用的主要方面之一,室间质评的目的是提高实验室肿瘤诊断与治疗高通量测序检测的质量。

对象:全国所有采用高通量测序检测的实验室,以及采用其他方法日常检测5种或5种以上基因突变的实验室。

样本:人基因组DNA样本。

费用:免费,质评结束后可收到结果反馈、小结行业质评证书。

截止时间:2015年5月25日

意义:肿瘤基因检测离规范应用又近了一步

基因检测技术曾多次被评为全球颠覆性技术,但是其混乱的商业应用也一直为业内所诟病。随着基因检测市场的火爆,市场上出现了各种各样的基因检测机构,其测序检测质量良莠不齐。有的是测序不准确,有的是认定的变异基因与特定的疾病没有关系,有的是基因与特定疾病有关系但却没有辨别出来,这些都会造成误诊误治。因此,对于基因测序的临床应用,需要进行统一规范和严格管理,否则对患者会带来很大的伤害。

除了无创产前检测,肿瘤诊断与治疗已成为高通量测序临床应用的主要方面。并且,相比于无创产前检测,肿瘤作为人类寿命的头号威胁,其发病率和消费刚需远远超于产前检测市场,因此,肿瘤检测成为测序领域当之无愧的下一块大蛋糕,国内多家基因公司已开始进入,纷纷布局,不过现阶段只有少数公司取得“官方入场券”。

2015年3月27日,卫计委医政医管局发布了第一批肿瘤诊断与治疗项目高通量基因测序技术临床试点单位名单,北京、上海、湖南、浙江、广东等多家机构入选,其中大部分是医疗机构,第三方实验室仅有华大基因、达安基因、迪安诊断、博奥生物等。这些公司入选试点单位,参加室间质评,将为提高实验室肿瘤诊断与治疗高通量测序检测的质量,更好地规范行业发展起到推动作用。由此,肿瘤基因检测离规范应用又近了一步。

延伸阅读:卫计委对高通量测序实验室的12个基本要求

卫计委对高通量测序实验室有哪些基本要求?卫计委临检中心副主任李金明对此作了解读,以下为10项基本要求:

1. 试点实验室应在国家卫生计生委批准的试点专业范围内开展临床检测工作。

2. 试点实验室需采用高通量测序开展不少于一项的检测项目。

3. 为避免污染所致的假阳性结果,各试点实验室应根据所开展的检测项目进行分区,具体各专业实验室的分区要求由国家卫生计生委临床检验中心负责发布。

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遗传病+肿瘤诊断与治疗实验室分区要求及示例

4. 试点实验室如使用商品化试剂,则应当使用经过国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准的试剂,临床应用前应经过性能验证;如使用自配试剂(LDT),必须建立自配试剂的标准操作程序,并经过性能评价。以上均须保存相应的实验记录。

5. 试点实验室应对相应的检测仪器设备进行日常的维护和定期校准,并保存仪器维护校准记录。

6. 试点实验室应对技术人员制定培训计划,进行相关的在岗持续培训,保存人员培训记录。

7. 试点实验室应建立日常检测的实验记录方式,并保存相应记录。

8.试点实验室应建立规范的检测结果报告与解释模式。

9. 试点实验室 应建立室内质量控制程序,在日常检测中开展室内质量控制,保存室内质控及其失控及定期综合分析的记录,并有质量改进措施。

10. 试点实验室应参加由国家卫生计生委组织的相应项目的室间质量评价或进行有效的实验室室间比对,并保存室间质量评价或实验室室间比对记录,对不合格的结果应进行原因分析,并采取质量改进措施。

11. 试点实验室应制定包括以下内容的标准操作程序(SOP)及相关记录表格:

(1)样本的采集、运送、保存、接收、登记和处理;

(2)知情同意告知;

(3)检测方法和步骤;

(4)试剂和耗材的选择和保存(如为自配试剂,需详细写明试剂的制备过程以及各原料的来源);

(5)试剂性能验证或自配试剂的性能评价和方法确认;

(6)仪器的使用、维护和校准;

(7)人员培训;

(8)结果报告与解释;

(9)实验室数据、相关文件记录与保存;

(10)室内质量控制;

(11)室间质量评价或实验室间比对;

(12)知情同意和保密程序。

12. 其他未尽的事项要求,试点实验室均应参照《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》。