月份:2015年11月

(转载)“清华校友求助”终见曙光——明码生物科技运用全基因组测序,发现罕见病患儿“林林”可能的致病基因突变


2015-09-20 基因组医学领先者 明码生物科技

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导读:清华校友会发布罕见病患儿“林林”五年未确诊的病例以来,多家知名研究机构和分子诊断公司都纷纷施以援手,希望能够尽快确定病因。复旦大学附属儿科医院与明码生物科技遗传病研究联合实验室也在第一时间与“林林”父母取得联系,利用联合实验室部署在中美两国的测序、分析、临床能力,包括Baylor医学院、波士顿儿童医院的专家团队支持,针对“林林”的病例设计检测方案,最终在9月16日把检测报告发送给“林林”家长,同时,后续的蛋白质功能验证工作也已展开。

关于“林林”的情况,请点击文章最下方阅读原文:

(转自TAALSM校友)

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在知悉“林林”案例后,联合实验室随即成立由中美临床专家、遗传学专家、生物信息学专家组成的团队,根据公开病例资料,确定了对一家三口直接进行全基因组测序和分析的策略;其优势是能够全面检测可能的点突变、插入缺失、结构变异等致病基因变异,也能够快速判断致病基因的来源。详尽的方案获得家长的认可和全力支持,并在9月1日获得了一家三口的标本。

全基因组测序工作进展迅速,9月5日即获得基因组序列数据。专家团队使用WuXi NextCODE平台的 CSA数据分析工具中自带的常染色体隐性遗传、de novo分析等多种分析模式,一天之内就识别出多个疑似致病变异;之后通过查阅文献、临床询证和会诊分析,在9月11日,锁定两个疑似de novo突变*,并立即进行了Sanger测序验证。9月13日,验证结果确认这两个疑似de novo位点存在。De novo突变的致病性要得到确认,需要最后进行蛋白质层面的功能验证;现在正在等待功能实验的验证结果。

*根据现有数据判断为de novo突变;将通过后续对患者妹妹“芊芊”的全基因组测序,结合家系数据分析判定是否为生殖细胞嵌合体。

9月16日,经过专家团队审核,联合实验室的儿科遗传学家为林林出具了基因组分析报告。通过家长与“林林”的主治医生沟通后,认为报告结论很有临床价值,将大大加速了患儿病因的确认。同时,“林林”家长结合了Baylor医学院、波士顿儿童医院及联合实验室中美专家团队提供的建议,并经过与“林林”主治医生的深入讨论后,授权联合实验室进行“林林”的妹妹——“芊芊”的全基因组测序和数据解读,藉此寻找更多关联信息和数据支持,进一步帮助确认病因和致病基因突变。截至发稿日,“芊芊”的标本采集工作已经完成。

罕见病的诊断及治疗需要全球科研社区的共同努力;联合实验室以及明码生物科技亦在此倡议社会各界人士关爱罕见病群体,群策群力,众筹众践,将罕见病研究从小众领域带至大众视野,让更多像“林林”一样的患儿和家庭重新体会平凡生活的温暖与幸福。经与家长讨论,联合实验室将向所有研究机构有限公布数据,如有需要,请与王清泉(wang_qingquan@wuxiapptec.com)联系咨询;在得到家长同意后,将通过最便捷的方式传递数据。

(转载)五年未确诊的罕见病,如今被抽丝剥茧–阜外、米宝首度公开林林基因数据


2015-09-04 宝姐姐 米宝有约

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2015年8月23日,题为《孩子罕见病,五年未确诊,清华校友求病因线索!》的求助信在朋友圈流传,一石激起千层浪,阅读量很快突破十万次。

一个名为Fellowship for Linlin的专家组在第一时间对林林(罕见病患儿)的病情进行了基因测序分析。这个专家组由来自清华大学、阜外医院、香港大学、美国南加州大学、米宝有约和北京希望组的专家群体组成,首先与林林的父母取得联系,建议进行全外显子、线粒体和CMD捕获芯片测序,结合已有的临床症状和生化检测,尽早确定病因,以期能对症治疗。

该方案在得到林林父母认可后,专家组成员以最快的速度赶往香港,成为第一个采集到林林血样的单位,并将样品立即进行基因检测。

经过几天紧张的工作,林林的线粒体测序结果已经完成。清华校友,米宝有约的CEO韦素碧表示:“目前,我们合作多方的大陆,香港及海外的遗传学家们正在有条不紊的进行线粒体数据处理和分析,并将结果告知患者父母。”。阜外医院分子诊断中心周洲主任表示,外显子测序的数据也将在本星期提供给患者父母,由他们邀请全世界的专家进行分析。

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大爱无疆,为了更快、更准确的找到孩子的病因,专家组表示,愿意在征得林林父母许可的条件下,公开孩子的基因数据,以期更多的遗传学家、临床医生参与进来,通力合作,确定孩子病因,并为进一步治疗提供依据。

背景介绍:

 

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照片里的一家三口是来自清华大学的夫妻和他们的孩子林林。在从满月开始,迄今将近6年的时间里,林林饱受疾病的折磨。尤其是在过去的一年半时间里,他都只能住在医院ICU病房里,靠呼吸机帮助呼吸。更令人不安的是,离孩子发病已经五年多时间,虽然有一些医生的推测结果,但确切的病因仍未确定!

孩子的病史(父母自述)

2009.12.11

足月顺产出生,出生体重3.37kg,父母双方及家族均无病史,妈妈孕产检均正常;

出生3日后正常出院,在家喂养当时吃奶比较久(不肯吃人奶,主要以奶粉为主),根据医生建议开大奶嘴后吃奶就比较顺利了;

出生后时我们发现比其他小孩哭声小,医生认为正常就没有太在意。20多天时发现睡觉有鼾声。

2010.01.11

满月当晚9:00在家吃奶后发现呕吐并吞咽下去(估计部分吞到气管里),之后12:00发现有声咳,当时发觉有所不妥,第二天早上7点多带到医院检查说是肺炎需要入院。

2010.01.12

入住香港广华医院,当晚在喂奶过程中孩子哭叫厉害之后窒息,因而安排进ICU。期间多次肺炎。咽喉支气管软镜和硬镜检查均正常,但吞钡餐检查(VFSS)显示吞咽困难,有少量奶会落到气管。

2010.01.22

气管镜软镜检查正常,医生让BB用口吃回奶

2010.01.23

早上在护士喂奶的过程中(大约70ml)血氧和心跳急速下跌,窒息抢救。第二次进ICU。

2010.02.19

吞钡餐检查,吞咽的过程中有奶进入气管

2010.02.24

香港玛丽医院全身麻醉,气管镜硬镜检查,正常

2010.03.11

脑磁力共振检查正常

2010.03.17

血检查发现CK高3-4倍(主要异常点)

2010.04.27

肌电图及神经传导检查

2010.05.14

吞钡餐检查,吞咽困难

胃酸倒流测试在2010年3月及5月各做过一次,正常;睡眠测试做多过于三次,结果为睡眠沉,血氧有问题,口水堵住呼吸。

2010年7月

广州儿童医院,食物敏感测试,吞钡餐测试,心脏,肝,脾胰脏超声波,DNA数量结构检查,SMA DNA基因检查,正常

2010年1月-8月

多次窒息呕吐

2010.09.16

肌肉活检,无显著异常;同时开了胃洞

2010年11月-12月

两次MRI检查正常

2010.11.16

神经传导检查,正常

2010.11.22

脑磁力共振检查,正常

2010.11.26

吞钡餐检查吞咽困难

2010年12月

再一次脑部核磁共振检查,正常

2011年1月

皮肤活检测试(Skinbiopsy),正常

2011.6-2013.11

2011年6月,出院回家,但晚上睡觉需带cpap呼吸机,否则血氧低。

出院后大概每1-2个月就会有一次肺炎,每次肺炎入院2个星期抗生素治疗后又可以出院。

之后cpap改成bipap呼吸机,因为发现晚上睡眠质量不是很好。

状态好的时候,白天3-4个小时可以不带bipap机,状态不好时需要24小时带bipap机。出院后可以手扶着墙壁走路。可以家长带着外出去公园超市1-2个小时。

2013.11.13

早上8点,在香港联合医院普通病房,护士在给林林注射肺炎抗生素时,林林哭闹很厉害至窒息,且窒息时间较长,之后就一直插喉管用呼吸机至今。

期间尝试了几次拔掉喉管改用Bipap机,但均不成功。

后持续在ICU病房至今。

已有诊断和病因推断

2010年2月

气管软镜/硬镜检查,排除了咽喉结构问题

2010年3月

血检查发现CK高3-4倍,医生开始怀疑肌肉病

2010年9月

大腿肌肉活检,纤维大小略有差异。

2013年1月

香港大学副教授Dr Sophilia Chan怀疑:congenital myopathy(先天性肌病) with no confirmed diagnosis, severe oropharyngeal dysphagia(口咽性咽下困难) and silent aspiration(隐秘性吸入性肺炎)

2013年9月

香港医生曾找英国医生找过以下病因:The name of the condition that we are suspecting at the moment is ‘ Alpha-dystroglycanopathy’(α抗肌萎缩相关糖蛋白病). The muscle disease is related to the loss of a muscle protein named alpha-dystroglycan. This can be a primary condition or secondary to other disease.

是2013年9月,第二次肌肉活检的时候发现肌肉里的Alpha-dystroglycan比较少,但是后来在2014年6月英国的Prof. Muntoni 再检视过发现这个的数量还可以,如果真是Alpha-dystroglycanopathy也会是不典型的。

2014年5月

现在林林的specimen study是在 Dubowitz Neuromuscular Centre in Great Ormond Street Hospital, London, UK 。

Under Prof. Muntoni and his team , he is willing to repeat some of the immunohistochemical stainings for Wei Lam’s muscle biopsy .

Alpha-dystroglycanopathy 这病他们在怀疑,不过做了stain 后发现如果是这病肯定也不是典型的这病。还有他们怀疑回去之前被否定的mitochondria myopathy(线粒体肌病)

2015年1月

针对Alpha-dystroglycanopathy做基因组测序,如检查基因不是这病的话会做全基因测序。至今未有结果。全基因测序还没做。

另外,目前有医生认为:可能是Phox2B基因突变,该突变可以参考:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1427/

(转载)华大基因完成对清华夫妇罕见病患儿测序,开放原始数据供解读


2015-09-04 同并相联

2015年8月25日,华大基因采集了一名叫“林林”的罕见病患儿的血液样本,进行了全外显子组检测以及线粒体测序。如今这两项测序均已完成,原始数据申请链接已对外开放,来自全球的专家团队均可在同并相联网站上申请获取原始数据(详见左下角【阅读原文】)。我们将在征询林林父母的意见后,将数据提供给您。
华大基因正在对林林数据展开深入解读。目前的发现尚需要结合其他数据(林林父母样本sanger测序,临床资料等)作进一步验证,关于解读的详情请关注我们后续的微信。
23日,一封清华校友的求助信《孩子罕见病,五年未确诊,清华校友求病因线索!》在朋友圈流传,引起广泛关注。夫妻均毕业于清华大学,但不幸的是,他们的孩子林林患上罕见疾病,几年来一直未查明病因。然大爱无国界,在七八千种罕见病面前,我们需要联合起来,群策群力,攻坚克难,不仅要查明病因、为患者进行对症治疗,而且要深入研究疾病,有效进行预防。
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患病的男孩叫林林(化名),2009年12月足月顺产出生。父母双方及家庭均无家族病史,孕产检均正常。出生后,林林哭声比其他小孩小,医生认为正常并没有太在意。20多天时发现林林睡觉有鼾声。给林林喂奶后曾多次出现异常。此后,父母带着林林辗转多个医院检查,但没有查明病因。在过去一年半时间里,林林只能住在医院ICU病房里,靠呼吸机帮助呼吸。(有关林林的病史,请点击左下角【阅读原文】查看)

孩子的父母均毕业于清华大学。几日前,他们向清华校友会求助。8月23日求助信发出后,很多专业机构和清华校友纷纷与林林的父母联系,希望能帮助诊断。华大基因的研究人员第一时间对病情进行了分析,并与林林父母深入交流,建议给他们全家做针对性的基因检测,以查明病因。8月25日,经林林父母同意,工作人员采集了林林的血液样本,并加急进行全外显子组检测以及线粒体基因组检测。为了给诊断提供更详细的信息参考,8月31日,华大基因采集林林父母的样本用于sanger测序验证。

目前,国内的清华大学、华大基因、复旦大学以及美国的贝勒医学院和南加州大学等知名学府和科研机构的专家在第一时间与患者父母取得联系,并成立了一个疾病诊治专家交流群。越来越多的专家汇聚到一起,共同为林林的疾病诊断提供帮助。

华大基因负责人表示,罕见病种类繁多,病因复杂,需要一个开放的平台供专业人士交流、破解病因。完成基因测序后,华大基因将第一时间在“同并相联”网站公开林林的基因测序数据。实际上,这也是林林父母的意愿,他们希望相关专家能共同解读基因数据,在尽可能短的时间内分析病因。

如何申请解读林林的数据?
点击左下【阅读原文】按钮,进入【同并相联】上林林的专题页面,点击【申请数据解读】即可。我们会代您征询林林父母的意见,并在一个工作日左右给您答复。
病历资料
下载地址
http://pan.baidu.com/s/1bnAtL2R
请拷贝到浏览器打开下载,没有密码
您也可以分别下载以下文件:
部分病历
http://pan.baidu.com/s/1pJqYxnl
MRI报告
http://pan.baidu.com/s/1mg8F0Uk
肌肉活检报告
http://pan.baidu.com/s/1dD4PX3V
林林18个月大时病历
http://pan.baidu.com/s/1i3IVbaH
怎样联系林林的父母?
李道煌
微信:czarina1194486
邮箱:1194486@qq.com
 
郭苏强
微信:guosu374533775
邮箱:374533775@qq.com

(转载)来自TAALSM和林林父母的感谢信


2015-08-29 校友会  TAALSM校友

8月23日,我们发出了一篇文章:《孩子罕见病,五年未确诊,清华校友求病因线索!》,在短短几天内,文章得到了众多清华校友、热心人士的阅读和传播。

截至今天,清华生命科学与医学校友会(TAALSM)微信公众号求助原文有14.8万人阅读,有9464人进行了12524次转发,其他公众号或网络平台转发不计其数。

新媒体的强大力量帮助我们实现了以往难以想象的传播。

我们感谢所有关注和传播求助文章的清华校友和热心人士,谢谢你们对林林的关爱和帮助!

大家齐心协力带来的巨大传播,也让林林的病情得到了全世界科学家、医生和研究机构的关注。文章除了迅速在中国生命科学与医学专业人士间传播,还很快传播到了海外。

目前,有十几家专业机构已经或即将为林林提供免费的基因检测、遗传分析和病因确诊服务,他们是:

  1. 华大基因
  2. 清华大学医学院
  3. 北京希望组生物科技有限公司
  4. 北京德易检验所
  5. 某不愿透露名称在业内具有很高声誉的知名机构
  6. 美国贝勒医学院
  7. 广州嘉检医学
  8. 南加州大学
  9. 复旦大学医学院
  10. 美国哈佛大学波士顿儿童医院
  11. 盛诺一家
  12. Rare Genomics Institute China
  13. 美国约翰霍普金斯大学
  14. 北京航空医学研究所附属医院分子病理中心
  15. 上海市儿童医院
  16. 香港大学医院
  17. 北京国际医疗中心

(由于表示提供支持的机构众多,统计信息时从微信群、邮件、手机短信、电话记录而来,同时有多个人参与对接,为此难免遗漏,如贵机构已经与我们或林林父母联系,而我们未列入名单,请给本公众号留言,我们后续还会发文感谢。)

同时,我们感谢以下医院和医学院的医生根据现有信息,为孩子提供了可能病因分析:

  1. 北京协和医院
  2. 清华长庚医院
  3. 北京儿童医院
  4. 北京解放军总医院(301医院)
  5. 湘雅医学院儿科组
  6. 北京阜外医院

(以上为部分名单,后续会列示更多医院名单)

我们向所有提供建议和各种帮助的个人表示由衷感谢!由于人数众多,请恕不一一列出。

目前,已经由华大基因采集林林的血样进行测序,数据结果将会在网络上共享。

由贝勒医学院线粒体疾病检测主任张巍博士牵头组织了贝勒、南加大、复旦、华大等一起参与的国际临床专家合作组也已经准备完毕,待测序结果一出来,所有后续工作会跨国高效率展开。

我们谨向后续会继续跟进林林病因确诊的科学家致敬!谢谢你们的辛苦努力!

接下去,我们会和林林的父母一道,定期向广大校友和热心人士通报林林病因确诊的进展。

林林的父母,清华校友郭苏强和李道煌也特意向我们发来感谢信,向各界关心他们的人士表达他们的感激:

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2015年8月23日在清华生命科学与医学校友会微信平台报道了林林的事情后,我们收到了很多机构和朋友的关心和帮助,并收集到了很多有价值的病因线索。

8月25日华大基因公司和另外一家机构已经到香港联合医院采完血,免费启动了基因检测工作!这是我们一直期待并追寻了几年的检测。

微信求助发出后,我见到很多人在帮我们把求助信转发给身边的医学人士,也看到很多医学群在积极讨论林林的病因。

目前国内外众多知名学府和科研机构的专家在第一时间与我们取得联系,详细了解病情,积极提供诊断方案。

美国贝勒医学院的副教授张巍博士(现广州嘉检医学的CEO和医学主任)牵头建立了一个林林疾病诊治专家交流群,正在群策群力准备本周六提出诊断方案,周一约我们面谈诊断方案。

华大基因更是表态愿意一切从病人出发,将来如有需要愿意提供原始数据和行内专家共同解读,帮助确诊林林病因。

微信求助发出后,我们也收到了很多非医学人士的安慰与祝福。我想说你们精神上的支持和医学专家的帮助是同等的重要。

因为有了你们的帮助和鼓励,我们觉得未来的路不再孤单,我们也会更有信心和动力陪伴着林林走好未来的每一步。

基因检测结果出来后,希望更多的专家能汇聚起来,一起来解读检测数据,共同为林林的疾病诊断提供帮助。

我们再次感谢清华生命科学与医学校友会,感谢各位相识和不相识的热心人士对我们的无私帮助!

林林父母:郭苏强

李道煌

我们补充一个林林父母暂时遇到的困难:

广大机构和个人提出了很多建议,由于与香港医生交流需要使用英文,而建议中有很多医学专业名词。为避免出错,能准确传达大家的建议,他们希望能够有专业人士帮助进行一些翻译和校对的工作。

如您正好是相关专业人员,且时间允许,我们恳请您可为他们提供帮助,万分感谢!

罕见病是生命科学和医学领域的难点,而分子诊断技术为确诊罕见病提供了一定的可能性,清华生命科学与医学校友会(TAALSM)也祝愿这次能在海内外科学家的共同参与下,尽快确诊林林的病因,以提供有针对性的治疗。

最后,我们感谢信息技术革命带来的跨国支持和协助,让我们一起期待分子诊断和精准医疗的革命带来疾病诊断和治疗的突破!

(转载)林林病因诊断初步报告-①


转载自:“北京希望组  TAALSM校友”的微信公众号

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自8月23日我们发出《孩子罕见病,五年未确诊,清华校友求病因线索!》后,已过去两个多月。在这期间,林林和他的父母得到了众多清华校友、企业和媒体的关注。

我们在8月29日《来自TAALSM和林林父母的感谢信》中列示了提供帮助的机构名单,在这里我们再次感谢以下机构的大力支持:

  1. 华大基因
  2. 清华大学医学院
  3. 北京希望组生物科技有限公司
  4. 北京德易检验所
  5. 药明康德
  6. 美国贝勒医学院
  7. 广州嘉检医学
  8. 南加州大学
  9. 复旦大学医学院
  10. 美国哈佛大学波士顿儿童医院
  11. 盛诺一家
  12. Rare Genomics Institute China
  13. 美国约翰霍普金斯大学
  14. 北京航空医学研究所附属医院分子病理中心
  15. 上海市儿童医院
  16. 香港大学医院
  17. 北京国际医疗中心
  18. 北京协和医院
  19. 清华长庚医院
  20. 北京儿童医院
  21. 北京解放军总医院(301医院)
  22. 湘雅医学院儿科组
  23. 北京阜外医院
  24. 优乐复生
  25. 米宝有约
  26. 水晶基因

(以上排名不分先后)

经过国内外众多机构、专家的共同协作,对林林、芊芊和父母的线粒体DNA、全基因组的测序工作已经完成,各家提供免费测序的机构也将测序结果进行了符合伦理规范的有限共享,多家数据分析机构和个人提供了分析报告。

从今天起,我们会陆续发布一些机构提供的报告,以向各位校友、关心林林的各界热心人士报告有关工作进展,同时希望借此可以向大家传递基因测序、遗传病和罕见病的相关知识,让大家了解罕见病确诊的艰难。也希望对基因测序、分子诊断的校友和专业人士仍然能够关注林林,关注行业的努力,共同推动行业发展。

今天的报告,来自“Fellowship for Linlin小组”。

注:“Fellowship for Linlin小组”由清华大学医学院、阜外医院、南加州大学、香港大学、北京希望组、米宝有约等机构组成。

林林基因测序数据分析报告

主笔:北京希望组

清华校友夫妇的孩子林林和芊芊罕见病的问题,由清华校友平台公布后,受到了社会和业界的广泛关注。三家测序公司或机构联系林林父母,进行了基因检测,希望找到致病的原因。

我们这支由清华大学医学院、阜外医院、南加州大学、香港大学、北京希望组、米宝有约等机构组成的被称为“Fellowship for Linlin”的小组,在尹银亮博士的协助下,首先获得了林林的外周血样本,同时进行了线粒体和全外显子组测序;随后华大基因也获得了林林父母的许可,同时进行全外显子组和线粒体的测序工作;药明康德明码生物、复旦附属儿童医院、贝勒医学院及波斯顿儿童医院等组成的小组也随即开展了林林样本的全基因组测序工作当中。

三方人员获得的数据及时进行了公开,以便让更大范围的专家学者参与数据分析解读,尽快获得确切结论,这确实也开创了一种公益性的“疑难杂症”遗传学分析的组织模式。

这三方的相关人员也集中在一个名为“林林的国际诊断合作组”的微信群内,与贝勒医学院、波士顿儿童医院等地的专家一块解读数据,讨论基因测序的结果。微信公众号“水晶基因”对整个过程进行非常不错的总结及评述,在这里我们不在重复叙述。

北京希望组作为其中的一个参与方,我们将已经公布的相关数据和我们的分析数据汇总整理,详细记录一下我们参与整个项目的过程,希望与大家共同努力加速对疾病病因的分析。以下我们分为事件背景,林林线粒体测序,林林外显子测序,武汉会谈,家庭外显子测序,基因拷贝数分析,总结等7个章节来详细还原事情的经过。

事件背景

事情的起始是源自于2015年8月,林林芊芊父母及清华生命科学与医学校友会发出的《孩子罕见病,五年未确诊,清华校友求病因线索!》的求助信,信中希望更多的专业人士能够提供关于该家庭罕见病病因的线索。信中详细描述了林林及其妹妹芊芊的临床相关信息。这些临床信息,是寻找并发现疾病病因的重要资料。林林芊芊的临床表型在微信上被简单归纳如下,但是具体的详细信息请参见原始的清华校友群平台的帖子。

2009年12月,林林出生了。他是足月顺产,之前的妈妈孕检也一切正常,且父母双方皆无遗传病史。只是刚下生的小林林哭声比较弱小,之后便出现喂食困难。继而又因肺炎,窒息等多种状况住院治疗。由于呼吸系统障碍,林林先是佩带BiPAP机来协助气流压入呼吸系统。之后情况进一步恶化,林林不得不接受经插喉管呼吸机。林林的父母为了找出病因,辗转各处求医。但均无确切诊断结果。

在林林将近2岁半的时候,他的妹妹芊芊出生了。刚出生的芊芊健康正常,但不久也出现轻度喂食困难。后来芊芊感染RSV病毒(婴幼儿常见)并出现多痰而住院治疗。幼小的芊芊在18个月时开始发生反复心肺衰竭。

经过详细的分析,从最初公布的林林与芊芊的临床信息中,我们发现林林和芊芊的临床症状比较复杂,无法确切获得可能的临床诊断结果,而且两个孩子之间相同或相似的临床症状较少,主要集中于肌肉病相关症状(如血液肌酸激酶-CK偏高,眼肌麻痹,近端肌无力等);其它临床症状差异较大(如林林主要表现呼吸功能不全,如呛奶、反复性肺炎、多痰、窒息等;而芊芊则主要表现为心脏功能障碍及心肺衰竭等),初步无法判断哪些症状是由遗传因素引起,哪些是由环境因素引起。

有鉴于此,通过与几个微信上面的专家群的讨论,我们认为首先以线粒体测序加上外显子测序技术为基础,寻找导致林林所患疾病的可能的遗传学病因是一个比较切实可行的方案。其它分析小组的专家也陆续采取了类似的实施方案。

值得强调的是,作为一个公益项目,虽然我们在免费帮助患者,我们也希望通过以符合国际规范的正规的流程来运作,所以从项目最开始,我们就利用了已有的伦理项目流程,并且与患者家庭签署了知情同意书。虽然我们不知道其他机构是否也通过了类似的流程与手续,我们认为这一步骤在遗传病诊断的公益活动中是必不可少的。

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图1. 照片里是来自清华大学校友和她的孩子林林,及两位医护人员。在从满月开始,迄今将近6年的时间里,林林饱受疾病的折磨。尤其是在过去的一年半时间里,他都只能住在医院ICU病房里,靠呼吸机帮助呼吸。更令人不安的是,离孩子发病已经五年多时间,虽然有一些医生的推测结果,但确切的病因仍未确定!

林林线粒体测序

由于林林与芊芊的具体表型差异很大,我们认为线粒体疾病有很大的可能性。其实一种病在不同个体表现各有差异, 最典型的例子就属线粒体疾病的异质性。一个携带有某种线粒体突变的母亲可以传递给各个子女不同数量的突变线粒体DNA,进而导致子女之间的临床表现迥异。

这里需要强调的是,我们没有办法取得林林的肌肉样品,所以采取了外周血,在香港大学医学院提取了DNA,然后在阜外医院分子诊断中心试验室进行Sanger测序。(在此感谢这些工作人员,他们牺牲周末的时间加班加点完成测序工作!)值得强调的是,在临床上有一种情况,是含有有害的线粒体的细胞在血液中的含量由于细胞生物学的原因会随着年龄增长不断减少,所以在血液中的含量可能比较低,在患者几岁之后有可能不容易甚至不能被测序的方法检测出来。

在测序结果出来以后,米宝有约发布了微信新闻,首先对社会公开了测序数据。数小时后,华大基因也发布微信新闻,公布由二代测序所产生的数据与他们对于数据的解释。经过我们自己Sanger测序数据的分析,我们没有能够找到可以解释林林疾病的突变。与此同时,为了防止这种低频的有害突变无法被Sanger测序找出来的情况出现,我们也重新分析了华大基因的二代测序数据(在此感谢华大基因对于二代测序数据的共享),虽然看到了一些比较罕见的突变,但是没有能够找到我们认为比较可信的致病突变。

林林外显子测序

在线粒体测序的同时,阜外医院的工作人员也在对林林马不停蹄的进行外显子组测序。与此同时,华大基因也在对林林进行外显子组测序。有鉴于外显子测序数据会有可能的隐私泄露的问题,所以数据的公布需要非常谨慎,一般为有限制的对于有专业能力的团队进行公开。在华大数据出来后在最短的时间进行了有限制的公开,所以我们将华大数据与阜外数据结合进行了分析,希望能够更准确的找出结论。我们的数据也在产生出来后,由米宝有约进行了有限制的公开。

值得强调的是,许多国内国外的团队对于数据进行了申请,也立刻在微信上发布对于数据进行五花八门解释的报告。这些团队加起来找出了十余个所谓的可能致病突变。在我们看来,这是一种不太负责任的做法,对于患者家庭和其亲属造成了不必要的困扰,对于公众也有一些误导作用,反而使得基因检测的公信力下降。当然,这些报告的出发点是好的,但是部分国内测序公司相对而言缺少严格的临床训练与医学遗传学背景,也缺少严谨的科学态度,把科研级别的报告当成临床级别的报告给出来了。所以,在没有明确结论的时候,公益性的组织最好只与患者家庭和专家团队沟通初步结论,而非因为各种各样的原因在媒体上匆忙发布信息。

我们小组的数据分析专家经过讨论得到以下结论:在林林的全外显子测序结果中,未发现可能的符合隐性遗传模式且对应疾病符合林林已知临床症状的变异(即基因中存在两个可能有害的变异或者一个可能有害的纯合变异)。这一结论否定了在微信上某些团队已公布的分析结果。造成这种分析结论偏倚的主要可能原因之一,是临床症状的高度复杂性,这种复杂性可能使分析人员无法确定:1)患者所患疾病是否一定为遗传病?2)临床症状中哪些可以由环境因素解释?等等问题。

武汉会谈

为了更准确地掌握相关临床信息进行进一步的数据分析,我们北京希望组的一个专家团队与林林母亲于9月11日在武汉光谷生物城进行了4个多小时的会谈,详细收集并分析了林林与芊芊的临床症状,主要是为了确定两个患儿的临床表型是否存在一致性;在繁杂的临床症状描述当中,分辨出哪些症状可能是由于遗传因素引起,哪些可能是由于环境因素(尤其是医疗干预手段)引起;如果不排除遗传病的可能,其可能的遗传模式有哪些等等问题。

我们认为,这种与患者家属的沟通对于罕见遗传病的检测及其重要,毕竟很多重要的信息可能没法从公众平台获得或被忽略。举例而言,许多罕见遗传病都有特异的面部畸形特征,所以面部畸形是临床上用来作疾病诊断的重要参考;林林有明显的面部畸形,如果光看照片可能会认为这是某种遗传病的标志。其实,林林妈妈告诉我们,林林出生后并没有任何面部畸形,所看到的表型只是因为长期携带BiPAP机压迫面部的后天原因造成的。

结合之前公布的临床信息,我们重新整理分析了林林和芊芊的临床症状,并提出了我们比较认可的假设,如下:

1. 出生后体征

(1)林林出生后哭声较小(芊芊出生后哭声正常,林林出生即表现有呼吸功能稍弱的情况,支持后期肌无力的推测);

(2)出生后3天出现喂食(吞咽)困难,满月出现呕奶、呛奶(之后出现肺炎), 肺炎住院期间,喂奶出现第一次窒息,转入ICU抢救。支气管软镜和硬镜检测显示正常。吞钡餐检查(VFSS)显示吞咽困难,其后喂奶时再次出现窒息(血氧心跳急速下降),严重时全身发紫。之后,林林身体状况变得更为糟糕,这个可能导致脑发育损失的事件可能是后期多数严重的运动能力障碍(如面部及肢近端肌无力,眼肌麻痹,爬行能力较弱,颈部无力,一岁半时不能单独走路,两岁多时有明显改善,睡眠时常伴有痰液过多的情况,长期需要物理排痰等)的分水岭;(芊芊则可以较好地进食,但仍表现出肌肉无力的症状。出生后兄妹两有不同程度的支持肌无力的临床表现。后期的严重的运动能力障碍可能是由于首次出现的严重窒息导致的继发性的医源性的功能障碍)。

(3)在出生后20多天,林林睡眠时出现鼾声;四个月时,发现林林在睡眠时,血氧异常,口水堵住呼吸(而芊芊无明显此方面异常,兄妹两人在呼吸系统功能方面表现不一致,但不排除芊芊肌无力的症状比较轻的,未发展到夜间睡眠呼吸功能异常的可能)。

(4)初始心脏功能正常,后出现心脏septum稍增厚,但无功能异常;而芊芊在首次出现心脏功能异常前,心脏功能及结构检测均显示正常。满月前后发生RSV病毒感染并入院治疗,16个月大时因肠胃炎入院治疗,18个月大时常规检测发现心脏发大,后在医院感染副流感病毒,出现心脏衰竭,抢救后定期服用Digoxin和Captopril在停止服用Digoxin后心脏再次发大,并引发心衰。(兄妹两人心脏的结构功能表现明显不一致,由于芊芊心脏在发病前无明显结构异常,心脏扩大及后期的心衰表现,发生在病毒感染后,暂时不排除为病毒所导致)。

2. 疾病家族史

父母双方表型正常,无家族遗传病史。

3. 遗传因素

由于两个患儿在出生后短时间内均表现出相近的(虽然程度有所差异)肌无力症状,所以目前仍无法排除两患儿所患疾病为遗传性疾病的可能。到底哪些性状是由遗传因素引起的呢?我们认为,面部及四肢无力(包括吞咽困难)可能是唯一的遗传性状,也在林林和芊芊身上共有。其他的任何性状都是后发性的或者是医源性的(如后期的严重的运动功能障碍,心脏的功能障碍等等)。

4. 环境风险因素

有很大可能是由环境因素导致的新发基因变化。这种新发突变每个人都会有,完全是随机的,只是偶尔会发生在导致疾病的基因上面,纯属坏运气而已。由于隐性遗传模式的分析方案未获得可能的候选位点,结合最新的在武汉会谈中得到的相关信息,我们认为需要立刻将思路往新发变异方面转移。

图2. 林林妈妈访问北京希望组位于武汉的办公室,与公司成员进行交谈,帮助更好的确定病因,以及更好的理解测序数据。

父母与芊芊外显子测序

与Sanger验证

基于武汉会谈的结果,我们决定对于林林父母也进行外显子测序,寻找新发突变来解释病因。感谢广州暨南大学医学院的研究人员进行了血样的采集和DNA提取工作,并且再次感谢阜外的工作人员进行测序!

对于家庭成员的全外显子组测序结果的分析后,我们发现至少三个新发变异,包括在PFKM,COL6A5和SIPA1中的错义变异,能够改变蛋白质的编码。根据我们的沟通,发现药明康德找到了其中两个变异(PFKM,COL6A5),但是并没有发现SIPA1的变异。

与此同时,我们与药明康德成为仅有的两家拿到芊芊DNA的机构,所以也进行了外显子组测序。测序结果表明,芊芊也有与林林相同的在PFKM和SIPA1 中的错义变异,所以这两个突变和基因的致病可能性增加了很多。

为了更一步确认不是由于测序的误差导致的假阳性,我们又针对这两个突变在全家四个人中进行了Sanger测序,结果表明完全符合我们在二代测序中的发现,也就是说,林林和芊芊都有在PFKM和SIPA1中的新发突变,但是父母没有。

SIPA1基因与疾病的关系尚无明确报道,位于该基因上的新发错义变异未被已有文献报道,不存在于已知变异数据库(包括1000G,ExAC,dbSNP,ESP,Clinvar,HGMD等)中。生物信息学预测软件(SIFT、Polyphen2等)均预测该位点为可能有害变异,物种间保守性高。该基因产物的相互作用蛋白GATA2上游调控蛋白编码基因FHL1,是多种临床症状截然不同的X连锁肌病的致病基因,主要共同临床症状为发病于儿童早期或成年期的严重的(或进行性)肌无力、血清肌酸激酶轻度升高及呼吸衰竭等。但是无直接证据证明该基因本身与肌肉病有关,所以尚无法确定该基因变异与已知临床表型之间的关系。

另外一个新发变异是位于PFKM基因编码区的错义变异,可能与肌肉疾病有关。 这是一个从未被报道的变异,生物信息学分析(SIFT,Polyphen2等)均预测是有害变异,物种间保守性高,已知该基因的致病性变异导致常染色体隐性疾病—糖原储积病,主要表现为肌肉疼痛痉挛,运动不耐,肌肉痉挛抽筋,劳累型肌病及代偿性溶血,根据最新的来自ACMG 2015年的基因变异临床意义判读指南,我们认为该变异为疑似的致病性变异。我们只找出该基因一个可能有害的突变,鉴于所有外显子的测序覆盖度都比较高,假阴性可能性不大(虽然也不能排除微小结构变异)。但是由于遗传模式不符合,所以没法给出确定的诊断。

图3. PFKM和SIPA1的基因变异位点在家系成员中的分布情况。该变异位点仅出现在林林和芊芊的测序数据中(父母未携带),从两个基因变异位点的测序深度及变异所占比例看其数据可靠性高,Sanger测序验证了这一结果真实。

基因拷贝数变异

鉴于我们只能找到一个在PFKM中的有害突变,我们认为存在由结构变异导致隐性遗传疾病的可能,所以下一步我们决定对于家庭进行基因拷贝数的基于Illumina 和博奥芯片平台的检测。这里要感谢博奥晶典生物技术有限公司和博奥检验,在知道我们短时间内没有Illumina 芯片后同意免费利用他们的DNA拷贝数检测平台对于家族进行检测。同时阜外医院及时找到Illumina中华八的900K芯片,也免费进行了基于该芯片的拷贝数变异检测及分析。

我们的初步分析结论:高密度的全基因组范围的染色体芯片检测未发现明显的与已知症状相关的致病性的结构变异。但由于染色体芯片在以上候选基因内部探针分布密度不足(与芯片探针设计分布及基因较小等情况有关),所以很遗憾,利用厂家的分析软件,我们无法从已有芯片数据中看出以上候选基因尤其是PFKM基因内的微小结构变异情况。

总结

经过将近3个月的连续科研,在其他研究团队都已经淡忘或者放弃林林这一个病例后,我们依然在关注,也在想尽办法进行更进一步的分析。尽管目前我们仍然没法给出100%肯定的结论,在这3个月奋战的过程当中,我们自己也接受了一次对于罕见遗传病的再教育,进行了一次对于基因测序行业浮躁现状的观礼,也认识了一些热心的志同道合的朋友。在此我们还要感谢各位在这场战役中提供专家意见与信息的学者和热心人,包括美国贝勒医学院临检实验室的多位教授,美国哥伦比亚大学的专家,美国费城儿童医院的疾病专家等等,就不详细列举了。

基于以上的研究工作,我们认为下一步的分析需要关注以下一些问题,以供学术团体探讨:

(1)关于线粒体的分析结果。目前线粒体的分析结果未发现临床意义比较明确的有害变异,结合线粒体疾病的遗传异质性,可知单独检测外周血细胞的线粒体情况可能会忽略对疾病相关区域组织(如肌肉组织,尤其是与呼吸系统相关的肌肉组织)的线粒体变异信息。

(2)高分辨率的全基因组范围的染色体芯片检测数据中,初步分析结果未发现可能的与临床症状有关的有害变异,下一步可能需要对芯片数据的原始数据利用更灵敏的软件进行详细的分析,以确定受检者基因组在更小的结构变异水平是否存在可能的有害的变异的可能。

(3)进一步的针对严重窒息导致的器官损伤的检测,有助于确定林林后期的严重的运动功能障碍是否是由于这种医源性的损伤导致;对芊芊所服用药物的作用机制、副作用情况、施用情况等临床治疗情况的分析,有助于确定芊芊后续严重的心肺功能障碍是否同样是由于医源性的损伤引起;这些辅助临床检测可以帮助理清临床表型中的遗传因素引起的结果和环境因素引起的结果,有助于排除数据分析中的干扰。

(4)在PFKM中只找到了一个可能的有害突变,不符合经典的PFKM的隐性遗传模式。不过,在遗传学上有很多例子,哪怕是隐性遗传疾病,也有些突变会有dominant negative的作用,使得有该突变的人产生临床性状(一般而言,与经典的隐性遗传性状可能有所不同,或是会轻微一些)。这种可能性非常大,但是需要更多的功能性验证。

(5)贝勒医学院的专家团队在仔细讨论临床表型后指出:现有的影像,病理和代谢的检测结果显示与他们见过其他肌肉病病例相比,也是非典型的。虽然遗传因素无法排除,临床也要考虑病毒类,或自身免疫性的原因。

(6)组织更广泛的专家团队,对已知的候选致病基因位点进行详细的可靠的体内或体外的功能学验证,进一步提供对遗传学分析结果的证据支持。虽然现阶段结果没有建立明确的基因诊断,但是不要着急和失去希望,对于临床上的罕见个例,许多病人都是花了较长的时间才解决问题。

(转载)林林病因诊断初步报告-②


转载自:“优乐复生  TAALSM校友”的微信公众号

11月3日,我们发布了关于林林病因的第一份阶段性报告,得到了广大校友和专业人士的关注。除了向大家汇报了林林病因诊断的初步结果,这份报告还让很多人第一次接触到遗传疾病的分析报告,有一定的科普意义。

今天我们发布第二份初步报告,来自北京优乐复生科技有限公司——

2015年8月23日,一封求助信《孩子罕见病,五年未确诊,清华校友求病因线索!》由清华校友平台公布后,受到了社会和业界的广泛关注。一对清华校友夫妇的孩子林林在出生后不幸患有罕见疾病,从满月至今近6年时间里饱受疾病折磨,目前已只能住在医院ICU病房里,靠呼吸机生存。

为尽快查明致病原因,包括清华大学医学院、阜外医院、复旦附属儿童医院、贝勒医学院、波斯顿儿童医院、香港大学、南加州大学、北京希望组、米宝有约、华大基因、药明康德明码生物在内的多家公司和机构联系林林父母,获得了林林的外周血样本,同时进行了线粒体和全外显子组测序;随后也获得了林林父母的许可,对数据进行了及时公开,以便让更大范围的专家学者参与数据分析解读,尽快获得确切结论。这与长期以来的测序-数据-分析流程全部由同一单位实施有所不同,可以说开创了一种公益性的疑难杂症遗传学分析的众包组织模式。

北京优乐复生公司作为其中的一个参与方,在获得北京阜外医院及华大基因分别提供的患儿林林的 WES 数据后,对数据进行了分析,后期又在阜外医院和米宝有约的大力帮助下,获得了患儿父母及患儿妹妹芊芊的WES及Sanger测序结果。在分析中,我们初步鉴定了一个疑似致病突变。目前,后续实验正在开展过程中。

在数据分析过程中,我们总结了一些经验教训,包括数据分析和生物学判断本身,也包括遗传罕见病的公益性组织模式。现将我们的参与过程详细记录,供更广泛的讨论和参考。

先症者背景

林林于2009年12月足月顺产,妈妈孕检一切正常,父母双方及其它家族成员皆无遗传病史。刚出生时的小林林哭声比较弱小,之后出现喂食困难,继而又因肺炎、窒息等多种状况住院治疗。三月龄及周岁脑部 MRI无异常发现,血液检查发现CK升高,肌电图显示神经传导正常,肌肉活检显示“纤维粗细差异”。六月龄始出现眼动障碍,体检示“心脏瓣片较厚但不影响功能”。由于呼吸系统障碍,林林先是佩带biCap机来协助气流压入呼吸系统,之后情况进一步恶化,林林不得不接受经插喉管呼吸机。林林的父母为了找出病因,辗转各处求医,但均无确切诊断结果。

在林林将近四岁时,他的妹妹芊芊出生。刚出生的芊芊健康正常,但不久也出现轻度喂食困难,后来芊芊感染RSV病毒(婴幼儿常见)并出现多痰而住院治疗。幼小的芊芊在18月龄体检发现心衰先兆症状,“院内感染副流感导致心肺衰竭”,服用地高辛后心衰症状康复,停服地高辛后心衰再次发作。

数据分析

优乐复生在获得了林林的原始测序数据后,即组织公司内最精干团队开展了数据分析工作,以期尽早确定致病原因。

按照林林及芊芊表型,神经网络分析可能为线粒体功能障碍,肌肉代谢障碍。另外,在分析林林的全外显子测序结果时,我们也发现林林携带较高比率的低丰度错义突变,体细胞突变率比数据库中的健康人群对照组相对高,提示DNA修复或基因组稳定性受到影响。由于林林的全外显子测序未显示DNA修复相关基因突变,我们怀疑呼吸链或能量代谢链受到一定压力,这也与前述的表型分析能相互印证。

由于母系家系无发病史,可初步除外母系线粒体杂合漂变,考虑常染色体突变。我们考虑了几种遗传模型,包括符合AR(常染色体隐性)的SNV/indel(SNV:单核苷酸突变;indel:短插入缺失),符合CH(复合杂合)的SNV/indel/SV(SV:染色体结构变异),de novo dominant(新生显性突变)的SNV/SV,以及外显率不完全的孟德尔遗传。我们首先分析了可能的AR/CH情况,但是没有发现任一基因上存在两个可能的致病变异。由于penetration非常强(两个孩子均患病),外显率不完全的概率也不高。这样我们只剩下denovo的一种可能。

因为没有父母对照,我们在林林测序数据中发现的单倍体变异是否属于新生变异实际上是不明确的,我们只能把测序数据中每个被发现的罕见突变都作为可能的致病突变来考虑,这么一来,仅仅需要分析的错义突变(改变蛋白质序列的突变)就达到了500多个。通过将表型输入神经网络进行迭代分析,我们得到了接近50个候选突变。

比较幸运的是,这里面还没有SV突变,都是SNV。否则的话,可能就没办法继续往下排查下去了。对于SNV,我们还能做结构。实在没办法,我们只能对每个携带突变的基因,找出其蛋白质晶体结构(有的只有同源蛋白质结构),一个个去做分子模拟。通过这种方法,我们排除了其它所有罕见突变,定位了一个和肌肉能量代谢相关表型符合,在人群中未发现的突变PFKM E629K。

PFK的中文名是磷酸果糖激酶,催化糖酵解的第三步。在人基因组中,存在PFK的两个homolog(同源基因)PFKL(肝磷酸果糖激酶)和PFKM(肌肉磷酸果糖激酶),另外血小板中还存在第三个同源基因PFKPL(血小板磷酸果糖激酶)。PFK以四聚体形式存在,在肌肉中,只存在PFKM形成的四聚体;在红细胞中,存在PFKM和PFKL组合而成的四聚体。PFK的底物是F6P(磷酸-6-果糖)和ATP,催化产物是F(1,6)P2和ADP。通过分析结构,我们发现PFKM E629侧链正好位于该结构的F(1,6)P2结合口袋(图1:A),该口袋也能结合PFKM的强别构调控分子F(2,6)P2,而后者是PFKM酶活的关键调节分子。E629K突变(图1:B,C,D,F)使整个结合口袋区的电荷分布发生了变化,从结构上来看(图1:E,G),酶功能会受到很大影响。这个结合口袋结构来源是酶二聚体,即使是一个正常的PFKM,结合一个突变的PFKM以后整个酶二聚体也会受到功能上的影响。因此,我们考虑PFKM E629K为一个显性突变。

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图1:A. PFKM 结构(hmPFKM: PDB 3O8N),示PFKM单体结构及E629。B/C:PFKM E629K突变(resi 629 as sticks);D/F: PFK1(hmPFKpl: PDB 4XZ2) E639K(PFKM E629同源氨基酸侧链, as sticks)突变及电荷分布图,红色为负电,蓝色为正电;E/G: F(1,6)P2(sticks)结合于结合口袋。

PFKM突变造成糖原贮积病 7 型(Tauri disease)。该疾病表型与林林肌肉表型部分相似。部分糖原贮积病 7 型病人为新生儿期发病并迅速发展。严重糖原贮积病 7 型表现为溶血及贫血表型,且运动后可能表现黑尿症,在林林病历中未见。林林携带E629K 突变为杂合,可能为显性负性,根据其蛋白结构推测,假如PFKM E629K为显性负性,肌肉在最坏情况下仍具有 1/4 PFK 功能,红血球在最坏情况下仍具有 3/4 PFK 功能(红血球中同时表达 PFKM 及 PFKL),为可能的一个解释。

在我们从蛋白结构角度入手获得疑似致病的PFKM E629K突变信息之后,我们向林林妈妈申请了父母及芊芊的全外显子测序数据,以及全家的CNV芯片数据。经过验证,芊芊和林林均携带PFKM E629K突变,而父母均不携带(图2)。从我们获得的信息显示,该结果也已被Sanger测序验证。另一方面,我们在不预设先验条件下,使用遗传模型对所有quartet测序数据进行过滤以后,使用神经网络对表型和基因型进行分析,同样只获得了同一个疑似致病的PFKM E629K突变。与单proband WES SV分析一致,CNV芯片分析没有发现任何可能致病的结构变异。因此,我们认为PFKM E629K突变的致病可能性较高。该突变在quartet中遗传模式符合de novo dominant模型,因此,我们认为该突变很可能为一个de novo显性负性突变,突变来源可能为父母其中一方的配子嵌合。后续确认还需要进一步的生化功能实验和分子生物学验证,正在安排展开。

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图2. 林林/父亲/母亲的PFKM E629K 突变位点二代测序覆盖结果。

总结

近3个月来,优乐复生科学家团队与林林的母亲及业内合作伙伴保持密切沟通,不断验证研究结果,利用数据分析技术鉴定了一个疑似致病突变,并将在此基础上继续协助林林父母对林林的病因展开进一步深入研究。在此我们首先要感谢所有无私提供测序及临床数据的相关机构,也要感谢林林父母同意我们将相关病历及分析过程作为案例向业内公开,与更多的专业人士和机构共同探讨和交流,为林林及可能的更多类似罕见病患者提供帮助。

在这个案例的分析过程中,优乐复生团队认为,尽管全外显子测序在罕见病诊断方面具有很强的解析能力,单测proband(先症者)的策略却很可能流于失败。实际上,在这个案例中,如果不是SNV突变而是一个haploinsufficient CNV甚至是SV,那单纯使用proband测序结果很难拿到结果;即使是SNV突变,如果不是恰好是个蛋白结构很清楚的突变,也没有做过生化,也很难说能不能拿到结果。另外,在测序中的许多平台/实验方法引入的错误,同样可以通过同平台的对照测序数据得以排除。我们认为,对疑难病人trio甚至quartet进行直接全外显子测序,可以缩短从测序到发现鉴定病因的时间,提高鉴定病因的成功率,在很多情况下,对病人是费效比较高的策略。对于某些特定种类疾病,在表型有嵌合特征时,可考虑高深度WES测序。对于SV鉴定,我们认为低覆盖度WGS的费效比应该更高。

其次,表型的鉴定十分关键。在这个案例中,UCL提供的肌肉活检报告提示“类CHKB肌病”,从病理层面直接鉴定了发病位置。临床表型相对复杂,许多表型可能是次生产生,不完全与遗传学有关,但对于严重疾病来说,一定存在一个核心表型直接与遗传背景关联。如何从纷繁复杂的表型中寻找出核心病理缺陷,既要依靠专业病理判断,也要依靠临床经验,还要依靠对生物学的深刻理解。目前优乐复生不仅依靠科研团队的判断,也使用机器学习算法对临床数据和观察结果进行特征分析。实际上,引入数据技术不仅能帮助临床表型判断,可能也可以通过相互迭代,逐步逼近核心基因型-表型关系。在准确判断表型的基础上,我们认为通过一些传统人类遗传学技术以外的方法,如将结构生物学,蛋白相互作用,深度学习发现的可变剪切等引入遗传分析,对鉴定的成功率也有很大的帮助。

最后,我们认为,这类类似“公益众筹”的疑难遗传病测序分析模式,在这次事件后会迅速流行起来,作为遗传病研究机构,优乐复生也很愿意参与。但我们认为其中的知情同意,法律授权,数据归属,结果交流,数据发布等环节需要进一步正规化,否则,对病人及其家庭并无实质帮助,甚至会有一定负面作用。

联系优乐复生:

北京市海淀区永丰工业园丰贤中路7号孵化楼B座4层

赵欣:zhaoxin@eulertechnology.com

0086-18610080763

 

美女总裁的骗局?从Theranos事件谈美国临床实验室的监管


在一个成熟的诊断市场,准确的诊断一方面来自于行业的自律,一方面也依赖于严格的监管。在经济利益的驱动下,诊断行业的参与者们就难免频频“出轨”。让我们一起来看最近风头正劲的Theranos的例子。

波谲云诡的Theranos
疗圈最近有一则颇为吸引眼球的新闻,风头正劲的检测公司Theranos被曝造假。Theranos号称发明了颠覆性的血液检测技术。此检测技术宣称不需要常规的静脉抽血,只需无痛手指穿刺微量取血,之后使用其专有的Edison仪器就可以完成200多项检测。而且同传统方法相比更快更便宜。Theranos的创始人兼总裁Elizabeth Holmes更是一个传奇人物。

Elizabeth 19岁在斯坦福上大二时退学创立了Theranos,现在年仅31岁公司的估值就高达90亿美元,她也因此有身家近50亿。而且她还是一个官二代加富二代,在美国政商军界都有深厚人脉, 其公司董事会中有两位前国务卿(包括老牌政治家亨利 基辛格),一位前国防部长等重量级人物。更加引人注目的是她还是一个金发大美女,而且永远穿一身黑,并且也如乔帮主一样挚爱黑色高领毛衣。她是个工作狂,把“醒着的每一个小时都用来工作”,并且以意志坚定,作风强硬著称。智慧,美貌,家世,财富,个性给予她一种睥睨众生的高冷范儿。但这一些都不足以相比这次的众多质疑让她领尽业界瞩目。

10月16日华尔街日报发文抨击Theranos夸大其词,弄虚作假。文章说Theranos的200多项检测项目中只有15项是用Edison仪器做的,其余的项目其实是用传统的方法和其它公司的仪器完成的。而且同样的病人用Theranos方法得到的结果同传统方法相比有着很大偏差。另外Theranos还有多项不符合临床实验室制度的违规行为。要说美女总裁就是个性鲜明,遇到问题从来就是迎难而上。她10月21日深入虎穴参加华尔街日报举办的研讨会,接受了公开的采访。Theranos于10月22日在其网站发布6000多字长文,几乎是逐字逐句地回应了华尔街日报的质疑,字里行间充满各种no, wrong, misleading, taken out of context, 看得出Theranos的律师团队做了大量的工作。回应文还给出了一些有趣的反驳证据。例如Theranos找到一位向华尔街日报提供证据的护士,护士要求2500美元一小时的采访费,Theranos说不知道她是否也向华尔街日报要钱了。

这里面到底水有多深,一般人还是雾里看花。Theranos被广泛质疑的有多个方面,例如云山雾罩的“Edison”仪器到底是个什么暗黑科技,无人知晓。Theranos的回应文一再强调Theranos作为临床检测实验室的资质,以此表明Theranos的高检测标准。 那么美国临床实验室的资质以及其监管体系是怎么样的?是否拿到资质在美国做诊断就毫无问题了呢?既然在这一事件中资质以及监管体系是为举足轻重的一环,那么水晶团队就借此契机聊一聊美国临床检测实验室的监管系统,然后和大家讨论下FDA目前对Theranos进行的调查。

 

除以上每年一次的综合全面检查外,临床实验室还要接受质评样本(Proficiency Testing, PT)的检测。PT质评就是把标准样品发放给有这个检测项目的各个实验室,反馈回来的结果同已知结果,或所有参加室间质评的实验室的综合结果比对。一个检测项目一年有两到三次送检,偶尔一次送检结果不合格影响不大,但是如果连续的三次送检中两次都不合格,那么可能就会收到警告信,甚至实验室的这个检测项目会被叫停。

CAP特别强调对PT质评样品的检测分析要同普通样品完全一样,以保证质评结果反映实验室的真实情况,而且严禁将室间质评样品送交其它实验室检测,或者实验室之间私下里交流结果。有些认真的实验室就煞费苦心,努力做到室间质评样品和其它样品一样,比如起个假名字什么的。一个实验室的检测项目中可能有的参加了CAP的PT质评,有的项目由于各种原因无法取得商业质评样本,那么就要做替代质评。替代质评可能通过同其它实验室交换样品来做或重新检测以前病人来进行。即使一个实验室的检测项目有专利保护而只有这个实验室能做,帅到没朋友,CAP也要求必须进行合适的替代质评。

纽约州对实验室的监管自成体系。不是说只有在纽约州的实验室要接受监管,而是所有做纽约州病人的实验室同纽约州相关的部分都要接受纽约州的监管。纽约州就是一个独立王国,什么东西都有自己的一套。实验室要通过纽约州的评审,实验室主任要有纽约州的执照,实验室的检测项目要得到纽约州的批准。请允许水晶在这里吐槽一下,许多时候他们的标准严格到近乎奇葩。比如纽约州对体细胞变异二代测序的指南,在要求平均测序深度至少500X的条件下,仍然规定二代测序结果一开始需要用一代测序验证单碱基置换和插入缺失。只有用一代测序累计验证了10个在某一基因中有单碱基置换的样品后,新发现的单碱基置换才可以只用二代测序报告,插入缺失与之相同。

FDA的调查报告

那么这么“‘变态”的监管体系是不是就万无一失了?现在我们再回到Theranos事件上。通过对美国临床实验室监管体系的介绍,我们可以知道这一体系虽然严格,如果刻意造假和掩盖,蒙混过关仍不可避免。例如CAP对实验室的评审两年一次,每次可能就只有一天时间,而且评审时主要看各种文档记录,不可能像中纪委办案一样查个底儿掉。室间质评送检时也不会派个人去实验室看着他们做出来。

假设Theranos真的弄虚作假,注意仅仅是假设,他们完全可以在实验方法有问题的情况下把纸面的数据做得很好看。就像华尔街日报披露一个Theranos的前雇员说一次他们做室间质评样品时分成两份,一份用Theranos的Edison仪器做,另一份用传统的仪器做。两个结果不一致时,管理层要求他们只报告传统仪器的结果。当然Theranos对此否认,说那只是做完室间质评后剩余的样品,拿来做了内部测试。这样来看,再严格的监管体系也不能杜绝所有的问题,但是临床检测来不得半点虚假,终究要靠事实说话。

说了这么多美国临床实验室监管,好像FDA的出镜率不高啊,这就涉及到临床实验室的LDT(Laboratory Developed Test, 实验室研发的检测)和IVD (In Vitro Device, 体外医疗仪器)的区别。如果一个检测项目是由一个CLIA认证的实验室研发的,并且只在这个实验室内部使用,那就是一个LDT。绝大多数的临床实验室的检测都是LDT。LDT现在还不归FDA管,虽然FDA虎视眈眈,极想掌控LDT,为此还出台了一个9年的计划。

IVD一般是仪器试剂公司在FDA的框架下研发的。如果一个实验室研发的检测项目在认证实验室之外的地方用了,比如Theranos在药房里进行检测,那么就是一个IVD,就要受到FDA的监管。(这里插一句,好像国内所有的临床检测项目都是需要CFDA批准的IVD,而没有不需审批的LDT。) FDA的权威性是接近一个世纪以来一代一代积累下来的虽然是个政府机构,但在医疗领域FDA基本属于一个独立王国。在医疗领域,它要说一件事要停,总统也没办法。FDA今年七月份认证了Theranos 的HSV-1 检测,并在8-9月对Theranos进行了实地评审。最近FDA在其网站上公布了有关这次评审的两份报告。第一份报告指出在Theranos 这一检测中共有9处不当之处。篇幅所限,不能一一列举,仅举几个方面给大家看看:

首先得到FDA指出的是Theranos当初极力宣扬的他们的微量取血所采用的Theranos毛细采血管 (nanotainer)。根据FDA规定,毛细采血管等采血装置属于血液及病理医学II类装置(FDA编码:864 6150)而非Theranos宣称的I类免检装置,其使用要遵循FDA有关医疗装置的管理与规定。II类医学装置不能随意散播,而Theranos运送,散播这一医学装置到加州,亚利桑那州和宾夕法尼亚州,属于违规操作。

FDA的报告有几处还分别指出Theranos在处理客户反馈方面的不当。一处是Theranos操作规范上的处理客户投诉的程序,同评审员听取口头介绍时了解的程序不一致。一处是有关客户的投诉没有完整的资料记录。另一处是有一客户的有关检测失败的投诉并没有得到及时的重审,评估和采取相应的补救措施。这也从侧面反映了Theranos在病人材料综合审查,评估以及和病人之间的交流可能等一系列问题。

另一个问题是Theranos 没有遵循改正和预防(Corrective and Preventive Actions,CAPA)程序。FDA要求对发现的质量问题如若寻求更正,需启动CAPA程序,分析问题的原因,记录改正的实施,并制定预防方案。但Theranos在这一程序上违规。例如Theranos曾经没有记录供应商的资质,他们发现了此问题,但是没有启动CAPA来调查分析原因。资质记录的缺失是否影响到了检测的质量,是什么原因导致记录的缺失,采购部门的相关人员是否需要培训,或者是其它部门相关人员需要培训,怎样才能预防类似问题的发生?这些都没有相应的CAPA记录。

几天前,FDA又把他们在今年8-9月间的第二次检查的调查报告也贴出来了。这次指出了5个问题:

比如实验室验证这一检测时并没有在实际情况下或模拟实际情况下进行。FDA认为Theranos的检测验证过程并没有表明他们的设计会在将来的病人服务中循用同样器材,遵循同一步骤,以期产生稳定重复性结果。FDA特别指出,某些器材的供给商编号,仪器信息和参照品信息都没有罗列清楚。

FDA继续指出Theranos的检测设计问题:他们的检测实施条件记录不清晰,没有达到FDA的相关规定要求。在他们递交的FDA文件中,并没有把检测所要用及的所有器材全部罗列其中。并且,在他们的记录中,没有充分详尽的分析这一检测的失误及错读风险。

最后,也是最容易更正的一点,但实在找不出Theranos为什么没做:指定人员没有检查,批准检测文档。不知这位指定人员现在的处境如何, 没签名咋算个正式报告涅?

前面说了,美女总裁不是吃素长大滴。Theranos针对FDA的调出报告作出反应:对于FDA在诸多程序修订,文档控制等方面的缺失或不完善,Theranos宣称他们正在处于一转型期,他们的实验室相关规则正在有CLIA调控转至FDA调控。但无论他们将来遵循哪一调控机构,对于程序修订的文档控制都有严格的规定。这一解释似乎牵强了一些。文中辩解的另一要点,微量毛细取血管的采用。Theranos同样宣称这一分歧也是其公司向FDA调控的转型所致。在未完成相应转型之前,他们的操作并无失误。另外,他们指出他们已经向FDA提交了有关这一转型的报告。但在他们的反驳中,并未提及FDA就其转型计划的批示。

总体上来看,Theranos在操作方面的确存在诸多违规操作。尤其是其宣称的东东与实际操作的确存在脱节的情况。既然这事儿搞的这么大,相信其他的监管机构也会逐步介入。以前的跟Theranos 积极合作的小伙伴们如 Walgreens, 最近也开始与其撇清关系。虽然很多辩论还在继续。我们期望愈辩愈明,就像柯南的名言:真相永远只有一个。

我们期待来自Theranos的真相。

医疗诊断事关人命,来不得半点虚假。必须慎之又慎。夸大其词的宣传虽可风光一时,却难风光一世。同时,我们也看到,一个优良的诊断市场需要参与者对游戏规则的充分尊重,在自律的同时,还要接受同行,政府,法律乃至大众各层面的监督和管理。他山之石,可以攻玉。分析这一事例,可以进一步发现我们自己的医疗诊断体系的不足之处。水晶期待与同行们一道共同促进分子诊断事业的良性发展。

参考网络连接:

1.http://www.wsj.com/articles/theranos-has-struggled-with-blood-tests-1444881901

2.http://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/reviews/k143236.pdf

3.http://www.fda.gov/ucm/groups/fdagov-public/@fdagov-afda-orgs/documents/document/ucm469395.pdf

4.https://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfpcd/315.cfm?GMPPart=864

5.http://www.fda.gov/ucm/groups/fdagov-public/@fdagov-afda-orgs/documents/document/ucm469396.pdf

6.http://www.fda.gov/ICECI/Inspections/InspectionGuides/ucm170612.htm

7. 图片来自网络

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罕见病基因检测,结果解读更重要。


转载自“测序中国”微信公众号

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在精准医学时代,先进检测技术的发展为罕见病的诊治提供了新希望。然而,在近日举办的第四届中国罕见病高峰论坛上,与会专家指出,仅仅依赖基因检测等技术手段的进步并不能为罕见病的诊治提供全面的解决方案,必须借助于更多领域、更多学科的配合,特别是临床遗传学专业人员对检测结果的科学解读,才能真正造福于罕见病患者。

基因检测成为重要手段

复旦大学出生缺陷研究中心常务副主任马端教授介绍,根据美国国立卫生研究院的统计,目前已知的罕见病约有7000种,其中绝大多数是单基因遗传病。只有了解疾病的病因,才能够实现诊治的精与准。目前,基因测序能力大大提高,成本大大下降,生物信息学的发展已经使得我们可以去解读测序中发现的问题。马端表示,基因检测有两个价值:一是研究价值,寻找遗传学的病因,确定检测标志物和治疗靶点;二是临床应用价值,可以开展遗传病基因的检测与分析,进行遗传咨询和科研服务等。

“基因检测已经成为罕见病诊断与防治的重要手段。”华大基因执行总裁尹烨指出,“在基因上没有人是完美的,平均每个人都会携带30个遗传疾病的缺陷。”基因检测技术不但能够验证疾病的临床诊断,为患者提供准确的遗传咨询服务,还能用于致病基因携带者的检测与产前诊断。

尹烨举例说,通过基因检测有效防治遗传病在历史上不乏成功的范例。在犹太人群中曾流行一种名为TSD的罕见病,即失明综合征。该病属于遗传性出生缺陷,有该缺陷的患儿出生后很快会失明,并且伴随各个系统器官衰竭,出生约4个月就可能死亡。为了控制这一疾病,犹太人依托教会,通过所有主流媒体进行宣传,开展大规模的孕前筛查。结果到2000年,北美地区的犹太人群中TSD的发病率降低了90%;2003年,全美诊断出的10个TSD患儿中,没有1个是犹太人。

罕见病发展中心主任黄如方认为,目前,罕见病患者迎来了最好的时代:在精准医学的热潮下,基因检测技术得到飞速的发展和应用。目前,我国的基因检测技术已经走在世界前列,检测的费用也已经降到1000元以内,大大提高了基因检测技术在临床诊断中的应用,有效提高了患者的诊断率,缩短了确诊时间,降低了确诊成本。

科学解读决定精准诊治

北京协和医院黄尚志教授指出,基因检测技术虽然在短短数年内取得了长足进步,但对罕见病而言,仅仅依靠技术的进步还远远不够。因为检测出的基因缺陷未必就一定会致病,呈现出来的表现型是基因型和后天环境共同导致的,基因型和表现型之间的对应关系尚待研究。也就是说,即使通过基因检测发现了致病基因,也并不表明100%已患上或将患上这种疾病。

“基因检测的结果需要被科学解读,只有被正确解读的结果才有意义。”黄尚志认为,精准医学的精髓在于把握患者的个体化差异,这就需要临床医生根据患者的病史、表型,结合基因检测结果来加以判断,基因检测只是帮助临床医生做出正确判断的重要工具。

“患者是否需要做基因检测或者产前检测,需要个体化处理。”中日医院运动障碍与神经遗传病研究中心负责人顾卫红研究员也这样表示。他说,虽然基因检测技术飞速发展,但是对于基因结构的认识相对不足,使得基因检测的临床应用尚存不少问题。比如,二代测序对罕见病的诊断非常重要,但缺乏质控,尤其是解读环节较为薄弱。细致可靠的临床表型的采集至关重要,应选择适合的检测方法,结合表型分析进行基因检测结果的解读。临床表型的数据与基因数据是否能被整合在一起,能否被准确地分析和解读非常重要,这也是目前所欠缺的,临床表型如何与疾病分类、遗传模式衔接仍需进一步分析。

马端也强调,基因检测不等同于简单的基因测序,最为关键的是把测序出来的结果解读好,为疾病防治服务。这需要做好三件事情:一是疾病的评估;二是疾病的基因诊断;三是通过基因检测指导临床用药。

“我国的测序技术已经领先,但测的越多,乱的越多。”同济大学附属第一妇婴保健院院长段涛教授认为,主要的原因在于没有合适的人员对结果进行解读,提高基因检测结果解读的精确性迫在眉睫。

段涛解释说,由于我国临床遗传学专业人员和遗传学咨询师的缺失,使得临床医生拿到基因检测结果往往不会解读。在欧美国家,有受过专门培训的临床遗传学家与遗传咨询师来对患者进行遗传咨询,但是在我国根本没有这两种专业体系。专业教育和培训体系的缺失,导致我国搞遗传学研究的人不懂临床,搞临床的人不懂遗传学,也不懂临床遗传学。没有正确的解读,就不可能将基因检测技术真正造福于人类。

段涛呼吁,相关人员的培训和教育是重要的环节,我国亟需建立“临床遗传学”学科,在高校中开展临床遗传学教育,培养专业人才,为罕见病患者提供正确的临床意见。马端则建议,除了参加临床遗传学的再教育外,临床医生也应加强相关知识的自学。

加强资源共享平台建设

目前,国内基因检测领域的公司之间交流甚少,彼此数据库之间没有形成共通。这使得许多需要进行大数据比对的基因检测结果只能在有限的数据空间内进行。尹烨建议,未来,在国家层面应建立数据互通的基因检测、疾病表型、患者信息共享大数据库,从而可以大幅度提高诊断速度和诊治的准确性。

顾卫红谈道,科技的发展和现有的诊疗模式存在矛盾。基因检测技术如今远远跑在前面,而临床表型的收集和分析则明显滞后。很多医生并不了解基因检测技术和业务的流程,缺乏相关的培训和继续教育,检测质量也参差不齐。医生、患者、检测公司之间的连接松散,缺乏有效的交流平台,模糊的临床表型与二代测序大量的基因数据建立连接容易出现问题。她强调,当前我国的医疗资源分散,基因数据应实现积累和共享,应尽可能地整合和开放健康人数据和不同种族、不同类型疾病的患者数据,并让更多人参与数据的解读。

受访专家均表示,希望测序公司都能尽可能地整合和开放数据,能将数据提交给医生,利用“互联网”将数据共享,供各国的科学家进行特定的研究。不过,这也会涉及到一系列的伦理道德问题,所以是一个长期努力的过程。同时,对基因测序检测结果的判断,还需要加强各学科之间的交流,需要整合多方面信息,包括临床信息、检测技术的选择、测序数据的最终解读等等。只有各学科协作,才能给罕见病患者以满意的答复。

段涛强调,基因检测至关重要,但解决罕见病的临床问题更需要一个整体解决方案,不仅包括由妇产科医生、儿科医生、临床遗传医生组成的临床团队和以测序平台为基础的罕见病诊断平台,还要与其他罕见病临床机构、实验室、研究机构、医药公司、政府组织、非政府组织加强合作。

顾卫红也呼吁,术业有专攻,合作非常重要,要通过临床、科研、产业、公益、政策法规等方面的合作共同推动罕见病的有效诊治。

来源: 中国医药报/白毅