青蒿素抗药性的故事


artemisinin

大家近来非常火爆的一个话题就是屠阿姨得炸药奖的事了,各种有关青蒿素的帖子在朋友圈刷屏。水晶跟风,也来谈一谈对青蒿素的抗药性。

绿的是青蒿素,红的是奎宁。可以看到青蒿素对疟原虫生命周期的抑制范围比奎宁更大。

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大家知道发现青蒿素的五二三工程的开展,是因为越南抗美战争中疟疾对奎宁类药物产生了抗药性而需要找到新的药物。青蒿素用了几十年了,在东南亚的下湄公河区域:缅甸,老挝,柬埔寨,泰国,越南。疟疾又对青蒿素产生了抗药性。

 

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这个问题很严重,因为青蒿素组合药物是世界上治疗疟疾的主力,2013年青蒿素组合药物被用了3.93亿次!如果疟原虫对青蒿素的抗药性传播开来,特别是传到疟疾多发,公共卫生条件又比较差,而且非常依赖于青蒿素药物的非洲,就会造成灾难性的后果! “千村薜荔人遗矢,万户萧疏鬼唱歌”,可能一点都不夸张。所以必须搞清楚对青蒿素的抗药机制,而科学家们近几年进行了一系列遗传学研究初步揭示了这一机制。

 

那怎么来研究疟原虫对青蒿素的抗药性呢?大家首先可能想到的是在临床收集一些抗药和不抗药的疟原虫样品,比较它们的基因序列。这个不是不能做,是不好做。自然界收集到的疟原虫标本之间千差万别,可能有属,种,亚种的差异,还有同一种内个体的差别。抗药与不抗药的差别可能就是一个DNA碱基的区别,淹没在疟原虫2400万个碱基的大海里。所以在没有强大的基因组研究手段的时候,可能还是从可控制条件的实验室开始研究。

 

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那在实验室怎么产生抗药的疟原虫株呢?就是把疟原虫在动物体内或培养皿里体外培养,先使用很低剂量的青蒿素,把活下来的虫株传代继续培养,再使用高一点剂量的青蒿素,再传代再培养。这样传了125代,用了5年时间,终于得到了抗药性强的虫株!抗药虫株是从不抗药虫株筛选进化来的,差别不像自然界中那么大,就比较好研究。

虽然比较好研究,但是在对疟原虫的基因组和遗传标记不了解的时代要找出抗药基因和抗药突变也不容易。上图是利用传统的育种手段和有限的遗传标记来克隆拟南芥的基因,疟原虫与此类似。就是要经过繁琐的杂交一代,杂交二代,可能还有回交,测交,各种交的过程,观察性状同遗传标记的连锁与分离,来定位克隆。

现在不用这么麻烦了!疟原虫的基因组已经测完了,而且现在有二代测序这样的大杀器。只要将抗药虫与不抗药虫做一下全基因组测序,然后比较序列就可以了。科学家发现在疟原虫13号染色体上的一个叫做kelch或者kelch13的基因决定了对青蒿素的抗性,而且也进一步得到了功能试验的证实。

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(绿的是野生型,其它颜色是四种携带不同kelch13突变的抗药型,纵轴代表在体外虫株用青蒿素处理后的存活比例。)

 

这是实验室中可控条件下做出的结果,那么自然界中是什么情况呢?科学家们做了进一步的研究。虽然自然界中采集的疟原虫标本千差万别,但是研究人员采用了另一个强大的研究方法,叫做全基因组关联研究(Genome Wide Association Study, GWAS)。人们用了60多万个单核苷酸多态性标记(SNP)分析了从东南亚地区收集到的1612个临床疟原虫标本。然后发现一些基因突变在抗性组中频率很高,具有很强的统计显著性。

 

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GWAS的曼哈顿图(象不象曼哈顿的群楼?)。 横轴是疟原虫的基因组,1-14号染色体,每一个点代表一个遗传标记,纵轴是统计显著程度,越高越显著。红线是全基因组范围经过修正的显著性阈值。可以看到13号染色体上kelch非常显著,达到了P = 4 × 10−26!同时有另外四个基因的突变也有显著差异。

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而且这四个突变的频率分布同kelch非常类似,就是说kelch的抗药突变是在这四个突变组成的基因背景上产生的。可能这四个基因不直接参与抗药的过程,而是可能抵消kelch突变给疟原虫带来的不利影响。

这些抗药性研究的意义重大。首先,现在有了基因检测手段,就可以用来监控青蒿素抗药疟原虫的产生和传播。

其次,通过这些研究,搞清楚疟原虫的抗药机制,就可以有针对性地设计新的抗疟药物。分离一个青蒿素,上千人折腾了十几年。用大海捞针来形容,一点也不为过。有了这些研究的结果,就有可能有目的地设计靶向药物,大大提高药物开发的成功率。

但是对疟原虫抗药性的控制仍然任重道远。青蒿素抗药性的产生原因是多方面的,有不正确用药,不按照医嘱的疗程服药,和青蒿素单药使用等等。世界卫生组织大力呼吁采用包含青蒿素和辅助药物的复合疗法,来控制对青蒿素的抗药性。

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最后来看一下肘后备急方对青蒿素的原始记载:

“治疟病方。鼠妇,豆豉二七枚,合捣令相和。未发时服二丸,欲发时服一丸。
又方:青蒿一握。以水二升渍,绞取汁。尽服之。
又方:用独父蒜于白炭上烧之,末。服方寸匕。
又方:五月五日,蒜一片(去皮,中破之,刀割),合容巴豆一枚(去心皮,纳蒜中,
令合)。以竹挟以火炙之,取可热,捣为三丸。未发前服一丸。不止,复与一丸。
又方:取蜘蛛一枚,芦管中密塞,管中以绾颈,过发时乃解去也。
又方:日始出时,东向日再拜,毕正长跪,向日叉手,当闭气,以书墨注其管两耳中,
各七注,又丹书舌上,言子日死,毕,复再拜,还去勿顾,安卧勿食,过发时断,即瘥。
又方:多煮豉汤,饮数升,令得大吐,便瘥。
又方:取蜘蛛一枚,着饭中合丸吞之。”

……

只是摘录一部分,看了这些奇葩药方之后觉得葛道人可能同蜘蛛有仇,屠阿姨能从这乱七八糟方子中发现青蒿素的抗疟疾效果真不容易,再次祝贺!

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