月份:2015年10月

5000万美元天价赔偿:深思一个遗传诊断与咨询的反例


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文/水晶基因

在精准医学的框架中,基因诊断是临床诊疗的环节之一。跟其它的诊断检测一样,它自有其标准,马虎仓促的诊断不但贻误病情,严重的状况就是草菅人命。

今年9月15日,诸大美国媒体机构报道了LabCorp诊断公司与Wuth一家的5000万美金的诉讼官司。尽管这一诉讼似乎已经尘埃落定,但对于我们诊断咨询界,却似乎不应就此翻篇,遗忘痛苦。我们是不是从这一案例中反思一番,有则改之,无则加勉呢?而对于诉讼的另一方,Wuth一家,也仅是为家庭里的小患者得到了一份经济保障,而相应的社会问题,家庭问题,则是漫长的,更不会随着胜诉而告终。

先我们从Wuth一家的家族病史谈起。

Wuth夫妇在2002 年迎来了他们的第一个孩子,是一个健康的男孩。夫妇俩一直想要更多的孩子。但他们的情况和其他家庭不太相同。Wuth家的男主人,Brock(II2)有一个严重残疾的母方姨母(I1)和母方表姐(II1)。由于诸多原因母方姨母遗传检测未有实施。而导致表姐残疾的遗传原因是一个9号和2号染色体水平上的变异,称为染色体间的非平衡易位(unbalanced chromosome translocation)。在得知这一情况后,Brock也进行了遗传检测, 结果表明Brock是这一位点平衡易位的携带者。本案例中的先証者是已经出生并有缺陷的小Oliver.如果个体携带的是平衡易位,这些个体通常并不表现任何临床异常,如Brock,Brock的妈妈,和Brock的舅舅,即图中所示的II2,I3和I2。而这些平衡易位的携带者均有50%的几率将这一变异传递给下一代。这些平衡易位的隐患包括可能导致流产,并且在向下一代传递是均有不同程度的风险突变为可能有像Oliver,或Brock的的表姐那样的严重致畸的非平衡易位。Brock一家的家系图谱见图一。有关染色体平衡易位和平衡易位的概念简介见后注。

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图一. Wuth 家系图谱,箭头表示患病的Oliver。

现在再回到Wuth夫妇的就诊过程。

2007年Wuth太太再次怀孕,夫妇俩为了确保自己的第二个孩子还像第一个一样健康,他们寻求了产前遗传咨询与诊断。他们向自己的妇产科医生特别强调了Brock携带有染色体平衡易位,并表明在此之前他们已经有多次流产。最后,他们表明,夫妇两个不想有一个像Brock表姐那样携带染色体非平衡易位的残疾孩子诞生。

于是,他们的妇产科医生在 Valley Medical Center(VMC) 给Wuth夫妇预约了进行绒毛膜胎儿样品取样用以鉴定染色体易位,并同时要求针对这一家庭的特殊情况进行遗传咨询。

不幸的是错误从Wuth太太被转至Valley Medical Center 就开始接二连三的发生了

首先,产前遗传诊断和咨询涉及到一个家庭的未来,关系到一个将要诞生的孩子健康与否,需要谨慎又谨慎。美国各个协会,如美国医学遗传协会(American College of Medical Genetics), 美国分子病理学协会 (Association for Molecular Pathology), 还有美国妇产科协会(American Congress of Obstetricians and Gynecologists)等等,都有相应条款和指南来严格管理产前检测。对于像Wuth夫妇这种有家族史的病人的产前检测,更应该是管理的重中之重。

但Wuth夫妇并没有得到正确的重中之重的礼遇对待。 VMC只是给他们安排了绒毛膜胎儿样品取样却没有安排对应的遗传咨询(第一个错误!)。取样后,按照美国CAP临床实验室的规定,只有专业人员才有资格给病人安排相应的检测项目并填写检测表格,以确保检测方接受到细致全面的病人背景材料。而在Wuth太太取样的当天,由于专业遗传咨询人员的缺席,当时的值班医生就擅自指定这一部分 由一个助手,一个资历并不合格的人员越俎代庖代替了(第二个错误!)。之后这个助手将填写的检测项目表格和所取绒毛膜胎儿样品送交LabCorp,来检测这一易位是否存在。尽管值班医生已经授意要提交Brock的检测报告,但助理只是在检测表格上表明了Wuth先生的家族病史为阳性, 却未把Wuth先生先前的遗传检测报告附上作为家族病史的一部分送交LabCorp(第三个错误!)。这里不得不表扬一下Wuth一家最初就诊的儿童医院遗传咨询的到位。他们明确指出这一平衡易位在遗传传递中可能变为非平衡的风险,并特别指出,荧光原位杂交(FISH)检测是最适合检测这一突变的技术手段。但在送交当天,这个助理只被值班医生特别叮嘱提交胎儿核型这一常规检测,因而也没有要求FISH这一更直接,更灵敏的检测项目(第四个错误!但这个错误是由于值班医生的疏忽导致,而非助理的责任)。过后值班医生也并没有向LabCorp确认,是否需要安排额外的遗传检测以确保无误(第五个错误!)。

Wuth一家的厄运并未随着就诊过程在VMC的结束而终结。错误还在继续。

样品被送到Labcorp后,一个缺乏产前诊断经验,还在接受培训中的技术员被安排单独做胎儿的核型检测(第六个错误!参照CAP临床实验室的Laboratory Personnel 部分和Competency Assessment 部分)。之后这个技术员并没有按照CAP临床实验室的的实验前要求来检查样品,查对病人信息(第七个错误!详见CAP 的 Pre-analytic 规则)。因此也就没有看到检测表中家史阳性的标识,也并不知道这一核型检测目的是去着重检查一个染色体易位。而没有经验的人员进行核型分析时,特别是不知道送检查目的,出现假阴性的漏检事故是十分有可能的。

这个技术员读片后认为结果是正常的,这一唯一的检测分析结果也获得了实验室主任的批准(第八,九个错误!见CAP analytic, post analytic部分和实验室 TeamLeader 的责任部分)。这一检测过程,对于一个慎之又慎的产前诊断,竟然没有安排第二个人审核结果,实验室主任在作做最后的审核批准时竟也没有询问这个家史阳性是什么意思?是什么样的家庭背景?这一产前诊断的目的是什么?这个阴性结果有无有经验的人员检查?等等一些列检测前后的错误,导致一个错误的“正常”结果就堂而皇之的反馈给了病人家庭。

于是就产生了这样一份报告,“胎儿核型分析显示,为正常男性核型(第十个,也是最不可挽回的错误!)注解:这一结果并不排除由于这一技术分辨率的限制而导致的微小染色体或先天缺陷漏检。”这里水晶想强调的一点是这一类免责性的注解在临床解读的报告中是常有的,但这并不是说有了这一注解就有了保护伞,就可以将所犯错误归之为技术缺陷。只要犯了错误,那就要为这一错误负责。之后,这一“好”消息由一个LapCorp资深人员电话告知了Wuth夫妇,“为正常男性核型,不携带染色体易位。”并将检测报告发送至Wuth太太的产科医生那里。

自此,Wuth夫妇安心等待自己的第二个健康孩子的降生。

但小Oliver的到来顷刻把Wuth夫妇的美后愿望破灭了。初生的Oliver 头颅狭小并倾斜扭转。指趾微小,手指细长而手体偏小。肌肉僵直而导致双腿无法拉直。小Oliver由于无法正常喂食进而体重迅速下降。他的诸多发育指标也远远落后。

随后证实小Oliver携带致病的非平衡染色体易位。这一缺陷带给小Oliver的是行动障碍,语言障碍,视觉障碍以及IQ70的整体脑发育滞缓。小Oliver需要终生24小时看护(见图二)。

之后Wuth夫妇开始了他们的讼诉。他们指责由于VMC 和LabCorp的疏忽,导致了他们的残疾孩子的诞生。经过长达去5年的讼诉,申诉,反申诉的漫长过程,最终,Washington Appeals Court最终裁定由Valley Medical Center 和LabCorp共同赔偿Wuth夫妇5000万美金,以供小Oliver的医疗,照顾所需。

也许,It is a good deal, isn’t it? 但有多少钱比有一个健康的孩子更重要呢?

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图二. 经接受漫长生理矫正和语言行为治疗的小Oliver,语言和行动能力均有改观,但仍需终生看护。

一个无法挽回的恶果总是有多个小错误一个个累计而成。如果其中的某次错误被敏感的捕捉,那么就不会有现在Wuth家庭的悲剧,也不会有这个巨额讼诉的产生。

让我们假设,如果,Wuth 夫妇接受了正规专业的遗传咨询服务;如果他们的送样有专业人士完成,表格有合格人员填写;如果有一个严格仔细的值班医生;当然还有,如果有一个有经验的技术人员操作检测;如果检测结果是严格按照临床检测要求审核解读。。。。。。

但结果是,这些如果都没有发生。这不得不让我们反思,这究竟是一个意外的个例,还是一个系统性的错误?如上所述,共有大大小小十余个错误在不同的时间地点发生。假设有一个错误被捕捉到,就有可能重新鉴定,给小Oliver一个正确的诊断。但这么多凌乱的错误就在这么多专业人士的审视下发生了,直至小Oliver带着最大的错误降生在这个世界上。

小Oliver今年7岁了。他不能像其他孩子一样奔跑,不能上上下下调皮的爬楼梯。他只能说几十个单词。Oliver的世界里只有他最亲近的几个家庭成员,他还不能理解更多的人。

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遗传诊断和咨询作为疾病诊疗过程中的关键步骤,需要临床医生,助手,实验室诊断师,技术人员,咨询师等所有环节的流畅的沟通和充分的讨论。在美国这样一个监管和质量管控很成熟的环境里仍然发生这样令人遗憾的案例,初听匪夷所思,细细分析则知,失去严格质量管控的诊疗过程导致这样的案例又是必然。这一事件在警示美国诊断界的同时,也给国内同行敲响了警钟。在全国基因诊断风起云涌的当下,在精准医学概念已经逐步切入医疗系统的历史时刻,构建一个高质量的管理和操作体系,专业正确的解读,传递遗传信息,即是立法者的责任,也是每个从业人员应当秉承的宗旨。所以,当我们面对病人,面对病人的文件,拿起病人的样品,请想一想遗传咨询和诊断带给了Wuth家庭什么,让我们谨慎再谨慎,专业再专业。


参考网络连接:

1. Wrongful Birth Lawsuit Ends in $50 Million Verdict. By Pintas & Mullins Law

Firm. http://www.medicalmalpracticelawyer.center/2015/09/wrongful-birth-

lawsuit-ends-in-50-million-verdict.html.

2. Jury awards $50 million verdict against LabCorp, Wash. hospital. By Michael

D. Abernethy / Times-News.

http://www.thetimesnews.com/article/20131213/News/312139858

3. LabCorp loses appeal in wrongful birth case, ordered to pay part of $50

million judgment. By Times-News.

http://www.thetimesnews.com/article/20150827/NEWS/150828952

4. www.courts.wa.gov/opinions/pdf/714970.pdf

后注:染色体平衡易位和染色体非平衡易位。在遗传学上,染色体易位是两条非同源染色体之间的遗传物质重组交换。这种易位重组可以是单纯的在两条染色体之间的交换而没有由此产生的遗传物质丢失或重获,这种易位叫做平衡易位。而对应的,如果这种交换导致遗传物质的丢失或获得,则成为非平衡易位。一般来是,平衡易位导致个体异常的可能性小一些。

林林离确诊还有多远?


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文/水晶基因

世界范围的关注与取得的进展——————–

近来林林的故事牵动着众多医务人员,遗传专家及关注这个特殊家庭的大众的心。水晶基因侦探员综合最新的进展跟大家共同探讨一下。

2009年12月,小林林出生了。他是一个足月顺产的男孩。之前的妈妈孕检也一切正常。父母双方皆无遗传病史。只是刚下生的小林林哭声比较弱小,之后便出现喂食困难。继而又因肺炎,窒息等多种状况住院治疗。

由于呼吸系统障碍,林林先是佩带biCap机来协助气流压入呼吸系统。之后情况进一步恶化,林林不得不接受经插喉管呼吸机。林林的父母为了找出病因,辗转各处求医。但均无确切诊断结果。鉴于林林的肌酸激酶偏高,一度初步判断为肌病。林林临床上支持肌病的表型还包括:大腿肌肉活检显示纤维大小略有差异,面部及四肢近端肌肉无力以及眼肌麻痹。

在林林将近四岁的时候,他的妹妹芊芊出生了。刚出生的芊芊是个面色红润,健康正常的小女孩。但不久芊芊便感染RSV病毒(婴幼儿常见)并出现多痰而住院治疗。幼小的芊芊和她的哥哥一样,也出现轻度喂食困难。芊芊在18个月时开始发生反复心肺衰竭,情况危急。

一个家庭中先后两个患病幼儿,在同情这个家庭的同时不得不思索其原因。究竟是巧合,父母遗传,抑或其他不明环境诱因?

先来对比一下两个孩子的临床表征。林林和芊芊的血检肌酸激酶(CK)都偏高。面部及四肢近端肌肉无力。眼肌麻痹。这些症状在就诊初期提示非典型肌肉病。另外,林林和芊芊的脑部核磁共振均显正常。当然,两个孩子的表现也有许多不同之处。比如,林林的主要障碍集中于呼吸系统功能异常,如多痰,反复肺炎发作,窒息等。而芊芊则主要表现为心脏功能不全,严重心肺衰竭。详情见表一。

表一. 林林兄妹临床症状比对

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有没有可能兄妹患同一种病呢?如果是同一种病,又如何解释林林和芊芊的表型上的差异呢?在遗传学上,携带同一突变而表型出现差异这种现象并不鲜见,一种病在不同个体表现各有差异, 最典型的例子就属线粒体疾病的异质性。一个携带有某种线粒体突变的母亲可以传递给各个子女不同数量的突变线粒体DNA,进而导致子女之间的临床表现迥异。另一个常染色体遗传的例子是LMNA相关的疾病。Brodsky等在2000年曾经报道过一个家系(1)。这个家系中有多个家庭成员携带有一个959位的T碱基缺失。但他们的临床症状却不相同。有三位患者疑似肌肉营养不良等肌病,其中两个有房室传导异常,一个房性心律失常,还有一个有扩张性心肌病。对于林林和芊芊的病例,至此只能说并不能仅根据两兄妹的临床症状差异就排除是同一种疾病的可能。

再回到林林和芊芊的病例上。由于林林和芊芊多年求诊未果,他们的父母于2015年8月求助于遗传诊断以期望从DNA水平上得以解释。带着对科学的探求和帮助幼小林林的心愿,多家机构,公司,院所伸出了援助之手。前后有华大基因,清华医学院,药明康德,北京阜外医院,美国贝勒医学院,复旦大学,美国哈佛医学院等十七家专业机构为林林提供免费基因检测和遗传分析解读。戴红政和张巍博士也曾专撰文《测序!测序!测序!为什么给林林测序?》。详细阐述了测序对于疾病诊断的重要性。测序数据的获得只是这个漫长过程的第一步。其中有来自清华大学,阜外医院,香港大学,美国南加州大学,米宝有约和北京希望组成的专家组第一时间采集到林林的外周血,对林林进行全外显子,线粒体和及针对先天性肌营养不良的基因组进行高密二代测序。华大基因也随后采集了林林的外周血启动了外显子组和线粒体二代测序。之后明码生物科技联合复旦大学附属儿科医院,贝勒医学院和波士顿儿童医院也于9月1日采样加入林林的测序队伍。9月4日,北京阜外和华大基因同时完成林林的测序,并公开测序数据邀请多方专家共同解读。随后明码生物宣布完成林林的全基因组测序。所有参与测序单位均以时间顺序列于图一。

图一. 参与林林测序的单位按时间列表

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水晶基因侦探综合了迄今为止各方公开的数据。林林接受的所有遗传检测见附表二。在大通量测序介入之前,林林在广州儿童医院进行了脊髓性肌萎缩(SpinalMuscular Atrophy, SMA)以及MELAS和MERRF等线粒体疾病的遗传检测。结果皆为正常。直到2015年的八月份,在多年的就诊过程仍未能得出患病原因的情况下,林林的父母又重新寻求进一步的遗传检测。在了解了林林和芊芊的病例后,先后有三组人员投入了紧张的测序工作中。他们应用二代测序技术涵盖了林林的线粒体基因组,外显子基因组以及全基因组。

清华大学/阜外医院和华大基因几乎同时完成了测序工作。并号召各个临床科室,商业运作单位,遗传专家参与到测序信息的分析解读中来。但之后清华阜外组宣布经过遴选,鉴定,所获序列变异皆不符合林林的特征和遗传方式。于是进而展开对林林父母的全外显子测序。目前测序结果尚未公布。

华大基因的初步解读结果于9月5号公布。在线粒体基因中检出一临床意义未明变异: MT-TE,m.14693 A>G。根据华大的判断和相关报道,该变异与其他致病突变同时存在时,会导致MELAS、耳聋、或LHON等。因此,这个变异更倾向于是个调控因子(Modifier)而非致病原因。 华大的外显子测序结果排除了先天性肌病缺陷突变(Congenital Muscular Dystrophy,CMD), 囊性纤肿和糖原累积缺陷。其他区域基于OMIM数据库和CGD数据库进行解读,均未检出与患者表型相符的已知或疑似致病突变。华大的验证工作仍在进行中。

表二. 基因测序结果

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之后华大的测序结果由北京德易东方转化医学研究中心解读公布。水晶基因侦探在此对这些公开的数据做了进一步的梳理,以期与业界同行共同探讨。首先我们想明确一点的是:如果一个DNA序列的变异在没有清楚的临床定义以前,在诊断界一般不倾向于称之为突变。这一点有别于科学研究报道。我们一般会称为变化,变异,未明序列变异等。对序列变异的标准分类水晶团队将另文详细介绍,敬请期待。

1.DNA2基因1个杂合突变:c.2618T>C,p.Y873C;rs200309792,等位基因频率为0.0002;水晶团队更正为ExAC数据库东亚人群频率0.0022;千人基因组数据库南亚人群频率0.001.DNA2 基因突变可以导致下肢肌肉无力,眼外肌麻痹,运动耐受能力下降。其遗传方式为常染色体显性遗传。德易破解的p.Y873C变异的等位基因频率为0.0002.这意味着如果这个变异为致病突变,将有万分之二的人患有此种疾病。而基于水晶基因的频率则患病频率更高。截至目前为止,公开的可见报道有4个病人携带有DNA2突变。鉴

于这一极低的发病频率,p.Y873C极为可能是一比较少见的中性的DNA序列变化,而非病理性变异。

2. TTN基因2个杂合突变:c.38378T>C,p.K12793R, rs189389531;等位基因频率为0.0034。水晶团队更正为ExAC数据库东亚人群频率0.014,千人基因组数据库亚洲人群频率0.014;第二个突变核酸改变为c.77158G>C,p.P25720A。等位基因频率为0.005. TTN基因是遗传性肌病早期呼吸衰竭(Hereditarymyopathy with early respiratory failure, HMERF)的致病基因。遗传方式为常染色体显性遗传。发病年龄多为成年。这一点与本文患者不符。大部分HMERF的患者的致病突变都是从同样携带有突变的父母那里遗传来的。这一点也与本文所描述的家庭相悖。同样的道理,两个DNA序列变化的相对高频率也一定程度上暗示这两个位点不太可能是病理性的有害突变。

3. MTMR14基因1个杂合突变: c.1316C>T,p.T439I。到目前为止,有关MTMR14基因功能的报道甚少。曾有报道MTMR14可能与中央核肌肉病变(centronuclearmyopathy)相关。但并没有十分有力的证据支持。这一疾病的遗传模式为常染色体显性遗传。这种病变的典型临床特征包括新生儿肌张力下降,近端肌无力和眼肌麻痹。但文中所述的兄妹在新生儿期均表现正常,并无肌张力下降,似乎也不支持MTMR14突变为这一兄妹的致病原因。但就这一变异而言,水晶团队倾向定义为功能未明变异(Variant of Unknown Significance,VUS).

4. SLC52A3基因1个杂合突变:c.1402G>A,p.P468S.SLC52A3是核黄素转运蛋白缺乏导致的神经元性肌病的致病基因。这一疾病的遗传方式是常染色体隐性遗传。这一疾病的特征包括神经麻痹,听力缺陷,肌肉无力以及呼吸问题。但所报道两个孩子都不显现听力丧失。另外,如果SLC52A3突变是致病遗传原因,那么这个基因应该有两个突变而非一个。因此从遗传方式似乎也不太支持这一变异是诱发林林临床病症的原因。水晶团队同样建议将这一序列变化定义为VUS.

5.原发性辅酶Q10缺乏症通路上的两个致病基因上分别发现1个杂合变异COQ2基因1个杂合突变:c.83G>T,p.A28E和COQ9基因1个杂合突变:c.625C>G,p.L209V,rs78846023; MAF为0.0048。水晶团队更正为ExAC数据库东亚人群频率0.01, 千人基因组数据库亚洲人群频率0.01。频率如此之高,提示不太可能是致病突变。这两个基因在德易的报道中有可能涉及原发性辅酶Q10缺乏症。这两个基因均为诱发线粒体原发性辅酶Q10缺乏症的核基因。其遗传方式为常染色体隐性遗传。这种缺乏症在基因水平上的发生原因一则为所以某一基因的纯合突变或复合杂合突变。而如果一条通路上的两个杂合突变并不能致病。现在回到德易所报道的两个变异上。假设第一个p.A28E为致病突变,我们需要找到第二个COQ2突变来支持我们的假设。第二个为一COQ9变异,其基因型频率为0.0048。同样道理,如果COQ2是致病基因,那么这个基因应该有两个突变而非一个。现在来简单阐述一下这一缺乏症的的临床表现,原发性辅酶Q10缺乏症主要临床症状为心脏衰竭,高血压和胸部疼痛。这些和兄妹两个的临床表现似乎都有出入。

6. BDNF基因1个杂合突变:m.81G>T,由于这个位点在测序中覆盖率不理想,不符合用于临床信息的要求,暂不作分析。

7. RYR1基因 c.135A>C,p.D1712A,由于这一变异的测序精确度不理想,不符合用于临床信息的要求。这里不予分析。

8. SPEG基因1个杂合突变:c.6304C>T,p.P2102S。这一变异的测序精确度也同样不理想,这里不予分析。

综上可见,目前为止以上序列变异没有非常强的证据支持确诊。需要指出的是这是德易公布的分析结果,并未得到华大的证实。

2015年9月20日,明码生物科技在他们自己的测序基础上,锁定两个疑似变异,并对这两个变异进行了父母一代测序,证实为后天突变(de novo)。然后他们进一步采集了林林父母和妹妹的血样,开展二期包括以上三人的全基因组测序。由于这两个突变并未公开,所以在此不予讨论。

我们离真相还有多远?————————

至此,我们综述了迄今围绕林林诊断展开的工作。以下水晶基因团队作为林林的关注者发表一些看法,期望抛砖引玉,与同行一道尽快找到林林的致病原因。

图二. 林林家系图。林林为先证者,以箭头标出。由于妹妹暂时无法定论是否与林林患有同一种疾病,所以暂时未涂实体阴影标为患者。

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首先,水晶基因团队希望先理清遗传诊断须遵循的一般思路——这一思路应当是临床(表型)+ 实验室(基因型)并重模式。虽然许多遗传病表型清晰,常规临床分析加序列测定证实即可找到致病原因,但也有不少遗传病的表型千差万别,很多时候以上模式是无法做出正确判断的。尤其是对罕见遗传病更是这样。林林的病例就是一个典型的例子。这一病例里面的关键问题是:林林和他的妹妹在临床表现上到底是相同还是不同的病理特征这一问题直接左右实验室和分析解读人员努力的方向。因为表型的统一性不但能够帮助判断一种疾病表现遗传与否,而且提示遗传疾病的遗传模式。有了这个模式,才能建立家系内表型和基因型走向上的相关性。这就意味着,最好在实验室检查之前,组织临床专家对林林和芊芊的临床症状做出详细的会诊,调阅所有以前检查的资料。截止目前为止,芊芊的临床检查信息还未公布。在缺乏临床数据的前提下,就有多个问题:

  • 他们的疾病是遗传病吗?儿童罹患疾病只有很少的一部分是遗传性的。有无可能林林和妹妹的临床症状并非遗传导致,而是他们所共同生活的环境中的某种致畸物质所至。这种观点听来似乎有些危言耸听。但致畸咨询分析向来是临床诊断和遗传咨询的一个重要组成部分。致畸剂可以是化学物质,也可以是某种临床治疗,或是怀孕过程中的病毒感染。最著名的例子当属在60年代用于医治早期孕吐的药物Thalidomide,这种药物会诱发胎儿的四肢发育畸形而产生“海豹肢儿”。在某些案例,母亲如果有长期的慢性疾病症状,也会导致孕程不顺利或胎儿致畸。再如母亲如果患有哮喘,那腹中的胎儿可能会由于没有足够的血氧供应而导致大脑或其他器官发育障碍。所以,建议是否在临床会诊中详细回顾父母的生活方式,健康状况,予以排除两兄妹胚胎或环境致畸的可能性。此外,鉴于林林和芊芊均有感染史,会诊中也需要理清原发性病症和继发性病症,以明确哪些症状最可能是先天遗传的。
  • 如果是遗传病,疾病的遗传模式是什么?无疑林林和芊芊的病例是十分罕见的,这给整个临床诊断增加了巨大的难度。第一个临床问题是,林林和芊芊是不是同一种病?大家在从父母和芊芊身上寻找佐证的同时就已经假定兄妹是同一种病症,并且是由遗传原因所致。假如是同一种遗传缺陷导致的兄妹两个的异常,那存在哪几种可能呢?如果父母正常首先会想到的是常染色体隐形遗传,父母为携带者,每次生育有25%几率孩子患病。两个孩子都患病的几率为25% x 25%, 为1/16. 常染色体隐形患病多见于相对比较闭塞的山区,部落,近亲结婚是隐形遗传等位基因纯合的最重要原因。林林和芊芊的父母非近亲结婚,并且双方皆无隐形遗传病史。这种情况在一定程度上减低了兄妹皆患同一种常染色体隐性遗传病的可能。第二种情况为母系线粒体遗传疾病。线粒体DNA的单碱基变异或拷贝数目重复多为母系遗传。而拷贝数目缺失多为新的后天变异。母系遗传即只有母亲才可以向下一代传递突变线粒体DNA。而患病的父亲由于在受精精卵结合时精子的线粒体DNA被丢弃而没有向下一代传递突变的风险。线粒体遗传的另一特点是异质性(heteroplasmy), 即每个细胞可含有不同数量,比例的正常线粒体和突变线粒体。因而不同后代个体因遗传变异线粒体DNA数量不同而导致临床症状各不相同。但携带有这一变异的母亲也可能由于异质性的存在而外观完全正常。还有一种可能就是生殖细胞嵌合体。顾名思义,生殖细胞嵌合体就是生殖细胞有两种甚或多种遗传物质相异的细胞群体组成。这种嵌合体可以存在于卵子,也可以存在于精子。而带有这个嵌合体的本人由于其他体细胞正常而并不发病。多数个体直到生育多个患病后代后才意识到自己的嵌合体状态。如果是常染色体隐性遗传疾病,几个课题组是可以通过测试血液样品寻查突变。但如果存在后两种情况,由于遗传机制的异质性,是否应该考虑测试其他来源的组织如肌肉组织,进一步测试线粒体遗传,而采取父亲的精液来测试生殖细胞嵌合体遗传
  • 目前的努力方向是假定这是遗传变异导致的疾病。即使做出这样的假定,业界投入了大量的测序工作,这样的工作会导向一个更加清晰的结果吗?先从林林的检测规划谈起。林林最初接受了SMA和两个线粒体疾病的检测。直到2015年夏,各个团体开始了全外显子,以及全基因组检测。在此之前,至少从目前公布的材料和病历来看,林林并没有接受基因组微阵列分析来鉴定是否有大的片段拷贝数目变异。此外,至少基于已公布的资料,我们并没有发现林林的核型资料(也许产前已作,未证实)。尽管WES和WGS在越来越昭示它们强大的技术魅力,但由于全基因组微阵列分析在搜寻小片断缺失或增加,染色体水平上的易位的独特优势,在当今的诊断策略,尤其是针对临床诊断未明症状,这一技术依然被列为常规分子检测中的第一选择。在今年8月份期的 Genetics in Medicine 报道了来自GeneDX的一个大规模的比较汇报借以阐述全外显子测序是否可以高效的检测小片段的拷贝数目变异(1)。在他们的报道中,他们平行进行了两项检测。检测一是将全基因组阵列比较杂交已经证实的拷贝数变异,覆盖12个已知缺失或增加盲加到WES中。测试结果显示,所有12个已知变异的WES数据和已知的阵列杂交数据相比,都显示不同程度的偏差。检测二是把WES所探测到的拷贝数目变异反向进行全基因组阵列杂交分析。他们随即挑选了54例具有临床病理意义的CNV进行检测证实。这54例中的34例得到了证实,其他20例由于各种原因,包括背景噪音,检测灵敏度等等而未能得以证实。无疑,这一工作提示我们,全基因组微阵列分析在搜寻拷贝数目变异水平是是不可或缺的。至少目前是不能为WES或WGS替代的。近期的JAMA报道了来自多伦多大学的工作(2)。他们在自闭症的基因诊断中进行了基因组微阵列分析和WES的比对。结果也显示目前基因组阵列仍应和WES相辅相成,这样才是最佳诊断方案。有无可能林林会携带有拷贝数目变异呢?业界是否可以考虑对林林进行全基因组微阵列分析呢

最后,水晶侦探提醒大家,DNA测序不是万能的。对未知遗传病的检查,WES的成功检测率只有15-25%。还有高达80%的病人即使进行了外显子测序但诊断结果仍然不明(3)。再者,WES的结果解释和证实是个巨大的挑战。至今尽管有无数的临床实验室和公司在努力开发各种解读方案和软件,解读的过程在很大程度上还是受到技术上的限制(4)。NGS结果的解释仍须紧密结合临床指征,家庭信息,仍然需要有丰富临床遗传背景和基因诊断背景的专业人士的详细分析,说它是一个侦探断案的过程毫不为过。水晶基因愿与各界同行一道,群策群力,为尽早揭示这一病因贡献力量。

林林的家庭是不幸的,对同一家庭出现这样的情况,相信所有的读者都感同身受。幸运的是,有这么多专家,课题组参与到林林的病因搜寻中来,同时,我们也应看到,这是一个艰难的攻关课题,它涉及到临床专家,基因诊断及遗传咨询的多方支持以及大量的财力、物力投入。我们共同期待林林案例水落石出的一天。也祝愿林林在不久的将来在基因诊断的辅助支持下,得到更完善的治疗,健康成长。

参考文献

1. Brodsky GL et al. Lamin A/C gene mutation associated with dilatedcardiomyopathy with variable skeletal muscle involvement.Circulation. 2000.

2. Miller DT, et al.Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostictest for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies.Am J Hum Genet. 2010.

3. Tammimies K, et al.Molecular Diagnostic Yield of Chromosomal Microarray Analysis and Whole-ExomeSequencing in Children With Autism Spectrum Disorder. JAMA. 2015.

4. Retterer Ketal. Assessing copy number fromexome sequencing and exome array CGH based on CNV spectrum in a large clinicalcohort. Genet Med. 2015.

5. Atwal PS etal.Clinical whole-exome sequencing: are we there yet? GENETICS in MEDICINE.2014.

 

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大象不得癌症?秘密在基因组里


1

 

人类的大部分癌症都与衰老有关。年龄越大,细胞分裂次数越多,发生随机突变的比例就越高。以次推理,那是不是细胞越多或寿命越长的动物,得癌症的比例就越高呢?英国牛津大学的流行病专家Richard Peto在1970年代做了大量的调查发现,罹患癌症的比率跟动物的体型和寿命并没有直接的关系。例如鲸鱼比人类的细胞多1000倍,大象多100倍,但实际上它们得癌症的比例却很低。大象死于癌症的比例大约只有4.8%,而人则有11-25%。这就是著名的Peto 悖论。这一悖论困扰生物学家多年。

2

几个物种结肠干细胞的数量(横轴)与估计的突变率(纵轴)。

最近美国的两个独立的团队通过对多个物种的基因组对比,各自发现大象的基因组内竟然有多达20个TP53基因的拷贝(40个等位基因)。 而人的TP53基因则只有一个拷贝(2个等位基因)。TP53 是著名的抑癌基因,是细胞内的”警察“。TP53基因的突变失活即会导致细胞生长分裂的失控。TP53的突变是人类癌细胞中最常见的变化之一。犹他大学的儿科肿瘤学家Joshua Schiffman与亚利桑那州立大学的进化生物学家Carlo Maley的合作团队通过对比大象和人类血细胞进一步发现, 大象的血细胞暴露于各种诱导癌症的环境中(如放射和化学诱变剂)时会更容易发生细胞凋亡。换句话说,大象的细胞一旦发现有问题,高活性的TP53蛋白可能倾向于让这个细胞直接死掉,从而避免发展成癌细胞。

3

非洲大象与人类外周血细胞暴露在离子辐射状态下的细胞凋亡。蓝色箭头显示大象外周血(左)正在凋亡的细胞。而人类细胞(右)则几乎找不到这样的凋亡细胞。

芝加哥大学的进化生物学家Vincent Lynch也几乎同时在大象的基因组数据中做出了同样的发现。虽然这一现象也许不是问题的全部,基因组数据的积累和比较却给人类的癌症发生提供了新的思路。那是不是给人类增加TP53基因的数量就会预防癌症呢?鲸鱼是类似的情况吗?这些问题随着研究的深入可能会得到进一步的揭示。

参考文献:

  1. Abegglen LM, Caulin AF, Chan A, Lee K, Robinson R, Campbell MS, Kiso WK, Schmitt DL, Waddell PJ, Bhaskara S, Jensen ST, Maley CC, Schiffman JD. Potential Mechanisms for Cancer Resistance in Elephants and Comparative Cellular Response to DNA Damage in Humans. JAMA. 2015; 8:1-11. doi: 10.1001/jama.2015.13134.
  2. Caulin AF, Graham TA, Wang LS, Maley CC. Solutions to Peto’s paradox revealed by mathematical modelling and cross-species cancer gene analysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2015;370(1673).
  3. Michael Sulak, Lindsey Fong, Katelyn Mika, Sravanthi Chigurupati, Lisa Yon, Nigel P. Mongan, Richard D. Emes, Vincent J. Lynch。 TP53 copy number expansion correlates with the evolution of increased body size and an enhanced DNA damage response in elephants. bioRxiv doi: http://dx.doi.org/10.1101/028522
  4. Ewen Callaway and Nature magazine. Scientific American, Oct, 2015.

青蒿素抗药性的故事


artemisinin

大家近来非常火爆的一个话题就是屠阿姨得炸药奖的事了,各种有关青蒿素的帖子在朋友圈刷屏。水晶跟风,也来谈一谈对青蒿素的抗药性。

绿的是青蒿素,红的是奎宁。可以看到青蒿素对疟原虫生命周期的抑制范围比奎宁更大。

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大家知道发现青蒿素的五二三工程的开展,是因为越南抗美战争中疟疾对奎宁类药物产生了抗药性而需要找到新的药物。青蒿素用了几十年了,在东南亚的下湄公河区域:缅甸,老挝,柬埔寨,泰国,越南。疟疾又对青蒿素产生了抗药性。

 

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这个问题很严重,因为青蒿素组合药物是世界上治疗疟疾的主力,2013年青蒿素组合药物被用了3.93亿次!如果疟原虫对青蒿素的抗药性传播开来,特别是传到疟疾多发,公共卫生条件又比较差,而且非常依赖于青蒿素药物的非洲,就会造成灾难性的后果! “千村薜荔人遗矢,万户萧疏鬼唱歌”,可能一点都不夸张。所以必须搞清楚对青蒿素的抗药机制,而科学家们近几年进行了一系列遗传学研究初步揭示了这一机制。

 

那怎么来研究疟原虫对青蒿素的抗药性呢?大家首先可能想到的是在临床收集一些抗药和不抗药的疟原虫样品,比较它们的基因序列。这个不是不能做,是不好做。自然界收集到的疟原虫标本之间千差万别,可能有属,种,亚种的差异,还有同一种内个体的差别。抗药与不抗药的差别可能就是一个DNA碱基的区别,淹没在疟原虫2400万个碱基的大海里。所以在没有强大的基因组研究手段的时候,可能还是从可控制条件的实验室开始研究。

 

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那在实验室怎么产生抗药的疟原虫株呢?就是把疟原虫在动物体内或培养皿里体外培养,先使用很低剂量的青蒿素,把活下来的虫株传代继续培养,再使用高一点剂量的青蒿素,再传代再培养。这样传了125代,用了5年时间,终于得到了抗药性强的虫株!抗药虫株是从不抗药虫株筛选进化来的,差别不像自然界中那么大,就比较好研究。

虽然比较好研究,但是在对疟原虫的基因组和遗传标记不了解的时代要找出抗药基因和抗药突变也不容易。上图是利用传统的育种手段和有限的遗传标记来克隆拟南芥的基因,疟原虫与此类似。就是要经过繁琐的杂交一代,杂交二代,可能还有回交,测交,各种交的过程,观察性状同遗传标记的连锁与分离,来定位克隆。

现在不用这么麻烦了!疟原虫的基因组已经测完了,而且现在有二代测序这样的大杀器。只要将抗药虫与不抗药虫做一下全基因组测序,然后比较序列就可以了。科学家发现在疟原虫13号染色体上的一个叫做kelch或者kelch13的基因决定了对青蒿素的抗性,而且也进一步得到了功能试验的证实。

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(绿的是野生型,其它颜色是四种携带不同kelch13突变的抗药型,纵轴代表在体外虫株用青蒿素处理后的存活比例。)

 

这是实验室中可控条件下做出的结果,那么自然界中是什么情况呢?科学家们做了进一步的研究。虽然自然界中采集的疟原虫标本千差万别,但是研究人员采用了另一个强大的研究方法,叫做全基因组关联研究(Genome Wide Association Study, GWAS)。人们用了60多万个单核苷酸多态性标记(SNP)分析了从东南亚地区收集到的1612个临床疟原虫标本。然后发现一些基因突变在抗性组中频率很高,具有很强的统计显著性。

 

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GWAS的曼哈顿图(象不象曼哈顿的群楼?)。 横轴是疟原虫的基因组,1-14号染色体,每一个点代表一个遗传标记,纵轴是统计显著程度,越高越显著。红线是全基因组范围经过修正的显著性阈值。可以看到13号染色体上kelch非常显著,达到了P = 4 × 10−26!同时有另外四个基因的突变也有显著差异。

freq distribution_调整大小

 

而且这四个突变的频率分布同kelch非常类似,就是说kelch的抗药突变是在这四个突变组成的基因背景上产生的。可能这四个基因不直接参与抗药的过程,而是可能抵消kelch突变给疟原虫带来的不利影响。

这些抗药性研究的意义重大。首先,现在有了基因检测手段,就可以用来监控青蒿素抗药疟原虫的产生和传播。

其次,通过这些研究,搞清楚疟原虫的抗药机制,就可以有针对性地设计新的抗疟药物。分离一个青蒿素,上千人折腾了十几年。用大海捞针来形容,一点也不为过。有了这些研究的结果,就有可能有目的地设计靶向药物,大大提高药物开发的成功率。

但是对疟原虫抗药性的控制仍然任重道远。青蒿素抗药性的产生原因是多方面的,有不正确用药,不按照医嘱的疗程服药,和青蒿素单药使用等等。世界卫生组织大力呼吁采用包含青蒿素和辅助药物的复合疗法,来控制对青蒿素的抗药性。

肘后备急方_调整大小

最后来看一下肘后备急方对青蒿素的原始记载:

“治疟病方。鼠妇,豆豉二七枚,合捣令相和。未发时服二丸,欲发时服一丸。
又方:青蒿一握。以水二升渍,绞取汁。尽服之。
又方:用独父蒜于白炭上烧之,末。服方寸匕。
又方:五月五日,蒜一片(去皮,中破之,刀割),合容巴豆一枚(去心皮,纳蒜中,
令合)。以竹挟以火炙之,取可热,捣为三丸。未发前服一丸。不止,复与一丸。
又方:取蜘蛛一枚,芦管中密塞,管中以绾颈,过发时乃解去也。
又方:日始出时,东向日再拜,毕正长跪,向日叉手,当闭气,以书墨注其管两耳中,
各七注,又丹书舌上,言子日死,毕,复再拜,还去勿顾,安卧勿食,过发时断,即瘥。
又方:多煮豉汤,饮数升,令得大吐,便瘥。
又方:取蜘蛛一枚,着饭中合丸吞之。”

……

只是摘录一部分,看了这些奇葩药方之后觉得葛道人可能同蜘蛛有仇,屠阿姨能从这乱七八糟方子中发现青蒿素的抗疟疾效果真不容易,再次祝贺!